2 .2. 4.1 Thử tác dụng giãn cơ trơn khí quản
* Nguyên tắc thí nghiệm: khí quản co lòng khí quản hẹp lại, cột nước trong mao quản tăng lên và ngược lại. Sự dâng lên hay hạ thấp cột nước
trong ống mao quản so vói mức ban đầu sẽ đánh giá được thuốc có tác dụng gây co hay gây giãn khí quản.
* Tiến hành thí nghiệm:
Giết chuột lang bằng cách đập mạnh lên đỉnh đầu, tách bóc riêng khí quản, cắt sát từ phần đầu cuống họng đến chỗ phân nhánh. Ngâm ngay khí quản vào dung dịch Tyrode nuôi khí quản. Bóc tách hết lớp màng bám bên ngoài, rửa sạch máu rồi lắp theo mô hình thử (hình 4).
Bơm dung dịch từ xi lanh vào lòng khí quản lên mao quản rồi ổn định ở
vị trí tương ứng vái vạch 0 mm. Ta phải tiến hành làm nhanh và đồng thời bơm liên tục không khí sạch vào ống nuôi khí quản, duy trì ở nhiệt độ 37°c. Để quan sát mực nước trong ống mao quản được rõ, dung dịch Tyrode trong xi lanh được pha màu xanh bằng xanh metylen.
Dịch thử được cho vào ống nuôi, trộn đều vói dung dịch Tyrode. Sau mỗi lần thử, rửa sạch khí quản bằng dịch nuôi Tyrode, để khí quản trở về trạng thái bình thường rồi mới thử tiếp.
1
1: Khoá giữ mao quản 2: Thước chia mm 3: ống mao quản 4: Xilanh 5: Ông nối 6: Khí quản cô lập 7: Ống mao quản chữ Ư 8: Ống tiếp dưỡng khí 9: Ông thay dịch nuôi
10: Bể nuôi bộ phận cô lập (ổn định ở 37°C)
Hình 4: Mô hình thí nghiệm nghiên cứu tác dụng co giãn khí quản cô lập.
Dịch thử gồm:
ACE: dung dịch acetylcholin 0,0025%
SA: Dịch chiết saponin toàn phần trong phương NTTGGLH tương đương liều 0.095 g/1 lần thử
FLA: Dịch chiết flavonoid toàn phần trong phương NTTGGLH tương đương liều 0.1 g/1 lần thử
Chú thích chiều cao cột nước trong ống mao quản dâng lên so với vị trí 0 ghi dấu (+), hạ xuống so với vị trí 0 ghi dấu (-).
1. Ảnh hưởng của dung dịch acetylcholin trên khí quản chuột lang cô lập.
Đặt mực nước trong ống mao quản ở vị trí 0, bơm 2 ml dung dịch acetylcholin 0,0025% vào ống nuôi khí quản. Quan sát mực nước trong ống mao quản sau mỗi lần đưa thuốc. Kết quả được ghi ở bảng 4.
Bảng 4: Ảnh hưởng của dung dịch acetylcholỉn trên khí quản chuột lang cô lập
Khí quản Chiều cao cột nước ( mm)
ACE 1 ( + ) 10,0 2 ( + ) 6,0 3 ( + ) 8,0 4 ( + ) 9,5 5 ( + )7,5 J ± S D ( + ) 8,2 ± 1,604
Nhận xét: Khí quản chuột lang cô lập đáp ứng nhạy cảm với tác dụng gây co thắt của dung dịch acetylcholin 0,0025 %. Chúng tôi chọn nồng độ này trong các nghiên cứu tiếp theo.
2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các dịch thử saponin, flavonoid toàn phần của NTTGGuf trên khí quản chuột lang cô lập ở trạng thái sinh lý bình thường.
Mực nước trong ống mao quản đã ổn định ở vị trí 0, bơm 2 ml dịch thử vào ống nuôi, quan sát mực nước thì thấy mực nước trong ống mao quản không thay đổi
Nhận xét: ở điều kiện sinh lý bình thường, thì dịch chiết flavonoid, saponin của NTTGGLH không gây giãn khí quản.
3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các dịch chiết flavonoid, saponin trên khí quản trong trạng thái co thắt bởi dung dịch acetylcholin 0,0025%.
Mực nước trong ống mao quản đã ổn định ở vị trí 0, bơm 2 ml dung dịch acetylcholin 0,0025 % vào ống nuôi. Sau đó quan sát mực nước, đợi ổn
định, bơm tiếp 2 ml dịch chiết flavonoid vào ống nuôi. Quan sát mực nước và kết quả được ghi ở bảng 5,
Bảng 5: Ảnh hưởng của các dịch chiết flavonoid trên khí quản trong trạng thái co thắt bửi dung dịch acetylcholin
Khí quản Chiều cao cột nước ( mm) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ACE FLA 1 ( + >11,0 (->1,0 2 ( + ) 12,5 ( - ) 0 , 5 3 ( + ) 17,0 ( 0 1 , 0 4 ( + )11,0 ( - ) 0,5 5 ( + ) 12,0 ( - ) 1,5 X ± S D (+)12,3 ±2,489 (-) 0,9 +0,418
Mực nước ổn định ở vị trí 0, bơm 2 ml dung dịch acetylcholin 0,0025 % vào ống nuôi. Quan sát mực nước, đợi ổn định, bơm tiếp 2ml dịch chiết saponin của NTTGGLH vào ống nuôi, trộn đều. Quan sát mực nước và kết quả được ghi ở bảng 6.
Bảng 6: Ảnh hưởng của các dịch chiết saponỉn trên khí quản trong trạng thái co thắt bởi dung dịch acetylcholin
Khi quản
Chiều cao cột nước ( mm)
ACE SA 1 ( + )17 ( - ) 1.0 2 ( + >15 ( - ) 0,5 3 ( + )12 ( - ) 0,5 4 ( + )11 ( - ) 0,5 5 ( + )14 0 J ± S D (+>13,8 ±2,387 (-) 0,5 ±0,353
Và kết quả so sánh được ghi ở bảng 7.
Bảng 7: Bảng so sánh kết quả các mẫu thử
TT Mẫu so sánh TTEST p
1 FLA-ACE 0.06 >0.05
2 SA-ACE 0.075 >0.05
Nhận xét: từ kết quả của bảng 5, 6, 7 chúng tôi thấy khi khí quản bị co thắt bởi acetylcholin 0,0025%, dịch chiết flavonoid, saponin toàn phần của NTTGGlhcó tác dụng giãn không đáng kể với p > 0.05.
Nhận xét chung: ở điều kiện sinh lý bình thường thì dịch chiết saponin, flavonoid của phương thuốc NTTGGLH không gây ảnh hưởng đến hoạt động của khí quản, còn ở điều kiện bị co thắt bởi dung dịch acetylcholin 0,0025% thì cả 2 dịch chiết đều có tác dụng giãn khí quản không đáng kể.
2.2.4.2. Thử tác dụng chống ho trên chuột nhắt trắng
Nguyên tắc thí nghiệm: Chuột nhắt sau khi bị kích thích bằng cách xông hơi NH3 đặc trong thời gian nhất định sẽ bị ho. Căn cứ vào số tiếng ho của chuột giữa nhóm dùng thuốc và nhóm làm chứng để đánh giá tác dụng chữa ho của thuốc. Mô hình thí nghiệm mô tả ở hình 5.
Hình 5: Mô hình gây ho cho chuột nhắt trắng
1 5
2 3
1: Bô can. 5: Dụng cụ nghe tiếng ho 2: Ống nghiệm dùng chứa amoniac. 6: Bề mặt tấm cách nhiệt.
3'Nồi cách thuỷ 7. Miệng ống nghiệm đựng amoniac.
4’Tấm cách nhiêt 8. Rãnh cho amoniac vào ống nghiệm
* Tiến hành: chuột nhắt trắng có trọng lượng 20 ±2 g đã thử phản xạ ho, số chuột có tiếng ho trong khoảng từ 20 - 40 được chọn làm thí nghiệm phản xạ ho. Chia chuột thành 4 lô, mỗi lô 10 con.
Lô 1: cho uống dung dịch nước cất liều 0,5 ml/ con
Lô 2: cho uống dung dịch codein phosphat 0,5%, liều 0,2 mg/kg thể trọng chuột.
Lô 3: cho uống dịch chiết alcaloid toàn phần liều 0,5ml/con tương đương với liều 0.32 mg/ con
Lô 4: Cho uống dịch chiết saponin toàn phần liều 0,5ml/con tương đương với liều 24 mg/ con.
Cho chuột uống thuốc 3 lần, mỗi lần cách nhau 12 giờ, riêng lần cuối sau khi cho uống 1 giờ thì gây ho cho chuột bằng 0,5ml amoniac đặc trong 45 giây (hình 5). Lấy chuột ra, cho vào dụng cụ để nghe tiếng ho và đếm số tiếng ho của từng chuột trong vòng 5 phút đầu tiên. Kết quả được ghi trong bảng 8, 9, '♦ và hình 6.
Bảng 8: Kết quả số tiếng ho trung bình của chuột
Mẫu thử Số tiếng ho của chuột Số tiếng ho
trung bình (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Lồ 1 39 32 38 33 35 37 39 39 38 37 36,7 ±2,54
Lô 2 4 5 3 4 7 8 6 5 8 5 5,5 ± 1,71
Hình 6 : Biểu đồ số tiếng ho trung bình của chuột 40 1 35 - I 30 - 25 - I 20 - 15 - 10 - 5 - I--- 0 --- 1--- ■---- 1---- ^--- ---1---- '--- ---1---- --- ---1
Lô 2 Lô 1 Lô 3 Lô 4
Bảng 9: Kết quả so sánh tác dụng giảm ho giữa các mẫu
So sánh TTEST p Lô 1- Lô 2 0 <0,05 Lô 3 - Lô 1 6,71.105 <0,05 Lô 4 - Lô 1 . 7,86.10-5 <0,05 Lô 3 -Lô 2 0,0873 >0,05 Lô 4 - Lô 2 0,0852 >0,05
Nhận xét: Kết quả so sánh từ bảng 8, 9 cho thấy kết quả giảm ho của các lô 3 và lô 4 gần tương đương vói kết quả dung dịch codein phosphat 0,5% với p > 0.05. Như vậy, các dịch chiết alcaloid, sap on in trong phương NTTGGlh có tác dụng giảm ho tương đương như dung dịch codein phosphat 0,5 % liều 0,2 mg/kg thể trọng chuột nhắt trắng.
* Nguyên tắc thí nghiệm: Đánh giá khả năng bài tiết dịch phế quản của chụôt nhắt trắng thông qua nồng độ đỏ phenol. Nồng độ đỏ phenol của chất thử càng cao biểu hiện tác dụng trừ đờm của chất thử càng tốt
* Tiến hành thí nghiệm:
Chia chuột thành 4 lô, mỗi lô có 10 con chuột nhắt trắng, cho chuột uống thuốc bằng cách dùng kim tiêm có đầu tù đưa thuốc vào dạ dày chuột, cho chuột uống 3 lần, mỗi lần cách nhau 12 giờ, lần cuối cho uống cách 30 phút thì tiêm vào phúc mạc chuột 0,5ml đỏ phenol 0,5% (pha trong dung dịch NaHC03 5%).
Lô I: cho mỗi con uống 0,5 ml nước cất liều 0,5 ml/ con
Lô II: cho mỗi con uống 0,5 ml dung dịch natri benzoat 3% tương đương với liều 75 mg/kg thể trọng chuột.
Lô DI: cho mỗi con uống 0,5ml dịch chiết alcaloid toàn phần của NTTGGlh tương đương với liều 0,32mg/ con.
Lô IV: cho mỗi con uống 0,5ml dịch chiết flavonoid toàn phần của NTTGGlh tương đương với liều 25 mg/ con.
Hình 7: Mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ thang màu chuẩn của đỏ phenol có nồng độ từ 0,1 ixg/ml -1 |ig/ml
Một giờ sau bộc lộ khí quản, rửa khí quản chuột 3 lần, mỗi lần bằng 0,5ml dung dịch NaHC03 5%. Gộp dịch rửa, đo mật độ quang (D) của dịch thử bằng máy quang phổ Trung Quốc UV-VIS 752 và so màu với thang màu chuẩn của đỏ phenol có nồng độ(C) từ 0,1 ịig/ml -1 |ug/ml (hình 7).
Số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp toán thống kê dành cho y sinh học với độ tin cậy 95%. Kết quả được trình bày ở bảng 10.
Bảng 10: Bảng kết quả thử tác dụng long đờm Lô thử n Liều thử D c (ng/ml) Lô I 10 0,126 ±0,03 0,186 ±0,02 Lô n 10 75mg/kg tt 0,227 ±0,02 0,596 ±0,03 L ô m 10 0,32 mg/ con 0,184 ±0,01 0,204 ±0,38 Lô IV 10 25 mg/ con 0.145 ±0,03 0,196 ±0,01
Hình 8: Biểu đồ kết quả thử tác dụng long đờm
0.7 1 0.6 - I---1 0.5 - 0.4 - 0.3 - 0.2 - !--- . I--- 1 I--- 1 0.1 0 1— ^ ^ ^ --- — I— --- — — ---
Bảng 11: Bảng so sánh kết quả các mẫu TT Mẫu so sánh TTEST p 1 Lô I —Lô II 0 <0,05 2 L ô I V -L ô n 0,529 >0,05 3 Lô ni - Lô II 0,755 >0,05 4 Lô IV - Lô I 5,78.105 <0,05
5 Lô III - Lô I 5,75.10"5 <0,05
Nhận xét: Dịch chiết flavonoid, alcaloidtoàn phần của phương thuốc NTTGGlh có tác dụng long đờm trên chuột nhắt trắng ở liều 16,67g/kg tt kém hơn so với Natri benzoat 3% ở liều 75 mg/kg thể trọng chuột với p > 0,05