2.3.3.1. Chuẩn bị MNC:
Sấy các mẫu Hòe hoa ở các mức nhiệt độ khác nhau (từ 100°c đến 140°C) trong khoảng thời gian 1 0', 15', 2 0 ' và 30'.
So sánh màu sắc của các MNC với mẫu sao qua, sao vàng ta có kết quả được trình bày ở bảng 2.6
r _ ___
Bảng 2.6: Màu săc của các MNCso với mâu sao qua, sao vàng
■ Ghi chú: - (++) Màu tương đương
- (+) Màu gần tương đương
Như vậy, các MNC đều có màu tương đương với các phương pháp sao qua, sao vàng trong chế biến Hòe hoa.
Xác định độ ẩm MNC bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi, kết quả được trình bày ở bảng 2.7.
Bảng 2.7: Độ ẩm của các MNC
Nhiệt độ và thời gian sấy MNC Độ ẩm (%)
Sống 1 0 , 1 1 100° c /10' 5,06 100°c/15' 4,69 100°C/20' 3,76 100°C/30' 2,75 110°c /10' 3,74 110°c/15' 3,46 110°C/20' 3,08 110°C/30' 1,82 120°c/10' 4,35 120°c/15' 2,92 120°C/20' 2 , 1 0 120°C/30' 1,18 130°c/10' 2,34 130°c/15' 1,92 130°C/20' 1,36 130°C/30' 0,09 140°c/10' 1,48 140°c/15' 0,90 140°C/20' 1,25 140°C/30' 2,09 - 3 0 -
2.3.3.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian sẩy
Các MNC chiết xuất theo quy trình trong hình 2.2. Dịch chiết thu được pha loãng 20 lần, lọc dịch chiết qua màng lọc 0,45|im. Định lượng bằng HPLC theo chương trình đã chọn. Khi sấy hòe hoa ở cùng nhiệt độ, sự ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng Rutin được thể hiện ở các hình 2.6 và ở bảng 2.8.
Bảng 2.8: Hàm lượng % (kl/kl) Rutin trong Hòe hoa khi sẩy ở nhiệt độ và thời gian khác nhau
Nhiệt độ sấy (°C)
Hàm lượng % (kl/kl) Rutin ở các MNC / Thời gian sấy (phút)
0 ’ 1 0’ 15' 2 0 ’ 30’ 1 0 0 28,78 26,51 25,89 25,98 25,89 1 1 0 25,96 26,33 25,42 25,81 1 2 0 25,34 26,17 26,47 25,95 130 26,64 26,00 26,53 26,65 140 26,49 26,86 25,56 25,72
Kết quả cho thấy ở tất cả các trường hợp (nhiệt độ sấy 100°c đến 140°C), hàm lượng của Rutin trong Hoè hoa đều giảm so với mẫu sống.
H àm lư ợ n g % (w /w ) H àm lư ợ n g % (w /w ) H àm lư ợ n g % (w /w )
Ảnh hưởng của thời gian sấy 100°c Ảnh hưởng của thời gian sấy 110°c 40 35 30 25 20 15 10 10 15 20 Thời gian (phút) a)Sẩyởl00°C 30 Ib i X Thòi gian (phút) b) Sấy ở 110°c 0
Ảnh hưởng của thời gian sấy 120°c
Thòi gian (phút)
c) sấy ở 120 °c
Ảnh hưởn g của thời gian sấy 130°c 40
10
0 10 15 20 30
Thời gian (phút)
d) Sấy ở 130 ‘U
Ảnh hưởng của thời gian sấy 140°c 40 n 35 10 J---T---T--- r---■ 0 10 15 20 30 Hiời gian (phút) e) Sấy ở 140%:
Hình 2.6: Đồ thị biểu thị sự tương quan giữa các MNC ở thời gian sẩy khác nhau với hàm lượng Rutin trong hoè hoa.
2.3.3.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ sẩy
Với cùng thời gian sấy, sự ảnh hưởng của nhiệt độ khác nhau được thể hiện ở các hình 2.7 và ở bảng 2.8. Kết quả cho thấy ở tất cả các trường họp (thời gian sấy từ 10 phút đến 30 phút), hàm lượng của Rutin trong Hòe hoa đều giảm so với mẫu sống.
Ảnh hưởng của n h i ệ t độ sấy (10 phút)
40 - 35 i ? 30 Ầ I 25 b 20 S ^08 X 15 10 Sống 100 110 120 N h iệ t độ (°C) 130 140 r a) Sây trong 10 phút
Ảnh hưởn g của n h iệ t độ sấy (15 phút)
W) Ib i £ 40 35 30 25 -I 20 15 10 Sống 100 110 120 N h iệ t độ (°C) 130 140 r b) Sây trong 15 phút
Ảnh hưởng của n h iệ t độ sấy (20 phút) Ảnh hưởng của n h iệ t độ sấy (30 phút)
ĩ ? &JD ib i s 40 35 30 25 20 15 10 Sống 100 110 120 130 N h iệ t độ (°C) c) Sấy trong 20 phút 140 * 'Ế w> b i £ 40 35 30 25 20 15 10 Sống 100 110 120 130 N h iệ t độ (°C) d) Sấy trong 30 phút 140
Hình 2.7: Đồ thị biểu thị sự tương quan giữa các MNC ở nhiệt độ khác nhau với hàm lượng Rutin trong Hoè hoa.
BÀN LUẬN
❖ Phương pháp HPLC là phương pháp phân tích hiện đại, đã được sử
dụng rộng rãi trong phân tích và kiểm nghiệm thuốc. Ưu điểm của phương pháp là độ ổn định, độ lặp lại và độ đúng tốt, thời gian phân tích nhanh.
Với chương trình sắc ký đã xây dựng, SKĐ của chất thử và mẫu chuẩn đều tách tốt. Kết quả thực nghiệm cho thấy phương pháp có độ chính xác cao (RSD= 0,99%) và độ đúng đảm bảo (tỷ lệ thu hồi 99,67%). Chương trình sắc ký đã xây dựng cho píc của Rutin gọn, cân xứng, độ phân giải cao, tách hoàn toàn khỏi các tạp chất khác trong mẫu thử, cho phép định tính và định lượng Rutin trong Hòe hoa.
Rutin được định lượng theo nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp cân, phương pháp đo màu, phương pháp quang phổ. Tuy nhiên sử dụng phương pháp HPLC khắc phục được nhiều hạn chế của phương pháp khác như: tốn thời gian, phải qua quá trình chiết tách phức tạp, tốn nhiều dung môi.
Hóa chất dụng cụ trong quy trình là thông dụng trong các phòng thí nghiệm. Do vậy, phương pháp này có khả năng ứng dụng nhiều trong các phòng phân tích và trung tâm kiểm nghiệm.
♦♦♦ So với phương pháp chiết thông thường, phương pháp chiết bằng cách lắc siêu âm có nhiều ưu điểm: Hiệu suất chiết cao, rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu, tiết kiệm dung môi hoá chất. Phương pháp chiết bằng siêu âm đặc biệt rất hữu ích với các mẫu dược liệu, là mẫu khó nghiền thành bột mịn, các chất phân tích tồn tại trong các tế bào và ít tiếp xúc với các dung môi chiết.
Phương pháp chiết bằng dụng cụ Soxhlet chiết kiệt được Rutin trong dược liệu. Tuy nhiên, thời gian loại tạp chất và chiết rất lâu. Nên khi tiến hành nghiên cứu với số mẫu lớn trong khoảng thời gian nhất định là không thích họp.
Trong điều kiện định lượng bằng HPLC là phương pháp có độ nhạy cao, có thể tách được pic của chất cần phân tích một cách dễ dàng, thì sử dụng phương pháp chiết bằng lắc siêu âm rất thuận tiện.
❖ Đối với các mẫu Hòe hoa đã được xử lý qua nhiệt độ: Hàm lượng
Rutin trong tất cả các mẫu đã xử lý qua nhiệt độ đều giảm so với mẫu sống. Có thể do tác động của nhiệt độ Rutin đã chuyển một phần sang Quercetin, Glucose và Rhamnose.
KÉT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT
1. KÉT LUẬN
1.1. về phương pháp chiết xuất
Trong khuôn khổ đề tài chúng tôi đã tiến hành khảo sát phương pháp chiết xuất Rutin từ Hòe hoa bằng Soxhlet - là phương pháp chiết thông thường và phương pháp chiết siêu âm. Kết quả cho thấy chiết siêu âm có nhiều ưu điểm vượt trội: tiết kiệm được dung môi, hóa chất và thời gian chiết xuất, quy trình đon giản và hiệu suất chiết cao. Đồng thời, chiết siêu âm cũng có thể chiết được nhiều mẫu trong cùng một thời gian. Phương pháp đặc biệt hữu ích với các mẫu dược liệu, là mẫu rất khó nghiền thành bột mịn, các chất phân tích tồn tại trong các tế bào và ít tiếp xúc với dung môi chiết.
1.2. về phương pháp định lượng
Từ những kết quả thu được chúng tôi đi đến kết luận: Xây dựng chương trình định lượng Rutin:
■ Cột Inertsil-ODS-3 (5ịxm; 250x4,6 mm). ■ Detector u v , bước sóng phát hiện 254nm
■ Pha động: MeOH - Tetrahydrofuran - NaH2P 04 0,05M (pH=3) (10:20:70)
■ Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút ■ Thể tích tiêm: 20|il
■ Nhiệt độ cột: 40°c.
Đánh giá phương pháp định lượng Rutin trong Hòe hoa cho thấy phương pháp có độ chính xác cao, độ đúng đảm bảo và có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic của Rutin và nồng độ Rutin.
Áp dụng chương trình đã xây dựng định lượng Rutin trong các mẫu Hòe hoa đã được xử lý qua nhiệt độ.
1.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng Rutin trong hòe hoa.
Hàm lượng của Rutin trong Hòe hoa tương đối ổn định nhưng đều giảm so với mẫu sống khi sấy (ở các nhiệt độ 100 - 140°c, với các mức thời gian 10-30 phút). Sự khác nhau của hàm lượng Rutin trong Hòe hoa khi sấy ở cùng nhiệt độ với thời gian khác nhau là không có ý nghĩa thống kê. Khi sấy ở cùng thời gian với nhiệt độ khác nhau cũng cho kết quả tương tự.
ĐÈ XUẤT
❖ Áp dụng phương pháp đã nghiên cứu định lượng Rutin trong các chế phẩm thuốc có chứa Hòe hoa hay Rutin.
❖ Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện hơn phương pháp chiết bằng lắc siêu
âm và định lượng Rutin bằng HPLC để bổ sung phương pháp chiết xuất và định lượng Rutin trong Hòe hoa vào Dược điển Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt:
1. Trần Tử An (2002), Phương pháp chiết và ứng dụng trong kiểm nghiệm thuốc
và độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr 70 - 71.
2. Nguyễn Phương Anh (2004), Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chế biến đến tác dụng sinh học của vị thuốc Đại hoàng, (Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 1999-2004), tr 24-36.
3. Bộ môn Công nghiệp dược (2006), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm tập 1,
Trường Đại học Dược Hà Nội, tr 146.
4. Bộ môn dược liệu (1998), Bài giảng dược liệu tập 1, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr 290-293.
5. Bộ môn Dược liệu (2006), Thực tập dược liệu (Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hóa học), Trường Đại học Dược Hà Nội, tr 18-21.
6 . Bộ môn Dược học cổ truyền - Trường Đại học Dược Hà Nội (2000), Dược học cổ truyền, NXB Y Học, ừ 306-307.
7. Bộ môn hoá phân tích (2004), Kiểm nghiệm thuốc, Trường Đại học Dược Hà
Nội, tr 93-98
8 . Bộ Y tế, Dược Điển Việt Nam tập I (1997), NXB Y học, tr 310-311. 9. Bộ Y tế, Dược Điển Việt Nam tập III (2002), NXB Y học, tr 378-379.
10. Bùi Quang Cung (2004), Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến thành phần hỏa học của vị thuốc Hoàng Bá, (Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ khóa
1999-2004), tr 18-27.
11. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, NXB Y học, tr 245- 259.
12. Nguyễn Văn Đậu (2001), Đóng góp vào việc nghiên cứu Flavonoid trong nụ hỏe, Tạp chí dược học số 304, ừ 13-15
13. Hoàng Đình Hợp (2002), Nghiên cứu kỹ thuật chiết xuất Rutỉn từ Hoa hoè,
(Khoá luận tốt nghiệp Dược sĩ khoá 1997 - 2002), tr 10 - 11.
14. Nguyễn Quốc Huy (2002), Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến tannin trong Ngữ bội Tử, (Khoá luận tốt nghiệp Dược sĩ khoá 1997-2002), tr 24-25 15. Nguyễn Thị Hương (2004), Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chế
biến đến tác dụng sinh học của vị thuốc Thảo quyết minh, (Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ 1999-2004), tr 2 2 .
16. Khương Thị Mai Lan (2003). Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến Flavonoid trong Hòe hoa, (Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ khóa 1998-2003), tr
17-36. ,
17. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr 298-299; 287-289.
18. Nguyễn Anh Ly (2003). Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến thành phần
hóa học và tác dụng dược lý của vị thuốc Hoàng liên, (Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 1998-2003), tr 25-29
19. Nguyễn Thế Minh (2003). Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến thành phần hóa học của vị thuốc Hoàng liên chân gà, Luận văn Thạc sĩ Dược học,
tr 39-86.
20. Thái Phan Quỳnh Như (2003/ Phương pháp phân tích bằng sắc kỷ lỏng hiệu
năng cao (HPLC), Viện Kiểm Nghiệm thuốc Trung ương - Bộ Y tế.
21. Phạm Xuân Sinh (1999). Phương pháp chế biến thuốc cổ truyền, NXB Y học, tr 124-125.
22. E. Beaufoy (1998), The extraction o f Rutin from Sophora japonica Using utrasuond, M. Sc. Thesis. Coventry University.
23. J.Q. Griffiths, C.F. Krewson, J. Naghski (1995) Rutin and Related Flavonoids; Chemistry, Pharcology and Clinical Applications, Mack Publishing, Easton, Pennsylvania.
24. Kee Chang Huang (1999), The Pharmacology of Chinese herbs, Second Edition CRC Prees, p 351.
25. L. Paniwnyk, E. Beaufoy, J.p. Lorimer, TJ. Mason (2001). The extraction o f rutin from flower buds o f Sophora japonica, Coventry University.
26. M. Vinatoru, M. Toma, T.J. Mason (1999), Ultrasonically assisted extraction o f bioactive principles from plants and their constituents, In: TJ. Mason (Ed.), Advances in Sonochemistry, Vol. 5. JAI Press, ISBN 0- 7623- 0331- X, p 209- 248.
27. Merck & Co., Inc, The Merck Index (1996) 12th Edition, p. 404
28. National Institute of materia medica (1999), Selected medicinal plants in Vietnam, Volume I, Science and Technology Publishing House, p 136-139. 29. Pharmacopoeia of The People's Republic of China (2000), English edition,
Volume I, p 12; p 51-52.
30. Yuangang Zu, Chunying Li, Yujie Fu, Chunjian Zhao (2006). Simultaneous determination o f catechin, rutin, quercetin, kaempferol and isorhamnetin in the extract o f sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) leaves by RP- HPLC with DAD, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 41, p 714-719 31. http://www.pdrhealth.com/drug-info
32. Y. Zhao, c. Bao, T. J. Mason (1991), A Study o f effective compositions from traditional Chineses medical plants, Ultrasonics International 91 Proceedings, Butterworths, p 87-90.