2.3.1.1. Khảo sát phương pháp chiết Rutin từ Hòe hoa
❖ Phương pháp chiết bằng Soxhlet
Kết quả thực nghiệm cho thấy, phương pháp chiết bằng Soxhlet với dung môi là methanol chiết kiệt được Rutin trong Hòe hoa. Tuy nhiên, thời gian loại tạp và chiết suất khá dài, quy trình có nhiều giai đoạn dễ làm mất mẫu. Nên khi tiến hành nghiên cứu với số lượng mẫu lớn trong khoảng thời gian nhất định là không thích hợp.
❖ Phương pháp chiết bằng lắc siêu âm
Với phương pháp chiết bằng lắc siêu âm, kết quả cho thấy dịch chiết sau 5 lần chiết cho phản ứng Cyanidin âm tính (-). Nghĩa là Rutin trong Hòe hoa đã được chiết kiệt. Phương pháp có độ chọn lọc và hiệu suất cao, quy trình tiến hành đơn giản, thời gian chiết suất rút ngắn, giúp tăng số mẫu chiết được trong cùng một thời gian. Phương pháp này rất thích hợp để tiến hành nghiên cứu với số mẫu lớn.
Những nghiên cứu gần đây cũng đã chỉ ra rằng chiết bằng siêu âm thời gian chiết ít hơn nhưng vẫn thu được hàm lượng hoạt chất tương đương. Theo Yuangang Zu, Chunying Li, Yujie Fu, Chunjian Zhao, khi chiết Flavonoid trong lá (Hippophae rhamnoides L.) bằng siêu âm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, hàm lượng Flavonoid thu được tương đương với chiết bằng Soxhlet trong 240 phút [30]. Khi chiết Helicid - một loại thuốc Trung Quốc điều trị chứng suy nhược, mệt mỏi - từ hạt Helicid erraticum bằng Ethanol, kết quả cho thấy đối với phương pháp chiết thông thường phải thực hiện ở 80°c trong 2h, trong khi đó sử
dụng phương pháp chiết siêu âm ở 40°c hàm lượng chiết tăng 50% và thời gian chiết suất giảm xuống còn 1 giờ [32].
Ngoài ra, một vài nghiên cứu gần đây cũng đã chứng tỏ khi sử dụng phương pháp chiết siêu âm, hiệu suất chiết luôn cao hơn so với phương pháp cổ điển thông thường [22], [25], [26], [32].
Vì vậy, trong đề tài này chúng tôi lựa chọn phương pháp chiết siêu âm.
2.3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký
a. Khảo sát hệ dung môi
Khảo sát trên các hệ dung môi:
- Methanol - Nước (50:50) (1)
- MeOH - Tetrahydrofuran - NaH2P 04 0,05M (pH = 3) (10:20:70) (5)
Kết quả trên sắc ký đồ cho thấy, khi phân tích mẫu với hệ dung môi 5 thời gian phân tích vừa phải, các píc gọn, cân xứng và tách nhau tốt, thời gian lưu của các chất là phù hợp.
Như vậy, chúng tôi lựa chọn hệ dung môi 5.
b. Lựa chọn cột sắc kỷ• • • %/
So sánh cột sắc ký lỏng RP18 (octadecylsilyl silica gel) cỡ hạt 5 và 10|im: Kết quả phân tích cho thấy: cột có cỡ hạt 5|j.m cho píc gọn, cân xứng, hiệu suất tách tốt hơn, thời gian lưu phù hợp...
c. Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng và nhiệt độ cột phân tích• • • o • • t I
Với tốc độ là 1,2 ml/phút và nhiệt độ cột phân tích 40°c cho đường nền tương đối ổn định, thời gian lưu thích họp và hiệu suất tách cao.
Methanol - H3PO4 0,5% (40:60) Methanol - NaH2P 04 0,05M (40:60) Acetonitril - NaH2P 04 0,05M (40:60) (2) (3) (4) - 2 3 -
Như vậy, dựa trên kết quả thực nghiệm thu được chúng tôi đề xuất điều kiện sắc ký như sau:
■ Cột Inertsil-ODS-3 (5 |0,m; 250x4,6 mm). ■ Detector ƯV, bước sóng phát hiện 254nm
■ Pha động: MeOH - Tetrahydrofiiran - NaH2P 04 0,05M (pH=3) (10:20:70)
■ Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút ■ Thể tích tiêm: 2 0 |0.1
■ Nhiệt độ cột: 40°c
Kết quả sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử được thể hiện ở Hình 2.3 và
Hình 2.4.
LiD -
IZĨ> -
Chrom Typ?: HPLC Chiim?1 : 1
í
Chrorn Typ?: HPLC Chinne1 : 1
nt» - LZt - LDD - _ LC - 4D RfbBtLOB Tim IALC|| ĨUM IiuaỊ
Hình 2.3: sắc ký đồ Rutin chuẩn Hình 2,4: sắc ký đồ mẫu thử Hoè hoa