3.4.2.1. Phương pháp phân lập
+ Lấy ựất mặt, ựất từ 5-10 cm, lá mục dưới ựất
+ Lấy 10g ựất, lá (ựã nghiền nhỏ) cho vào bình tam giác có 90ml nước cất, sau ựó cho vào máy lắc 200 vòng/phút trong 20 phút, thu lấy dịch lọc ựược ựộ pha loãng 10-1
+ Lắc ựều rồi hút 1ml dịch cho vào ống nghiệm ựựng 9ml nước cất, thu ựược dịch pha loãng 10-2. Tiếp tục pha loãng ựến nồng ựộ 10-3, 10-4;10-5, 10-6.
+ Dùng pipet hút 0.1 ml dịch pha loãng ở nồng ựộ 10-5, 10-6 nhỏ lên ựĩa petri có môi trường 1. Sau ựó, dùng que cấy trang ựều trên bề mặt thạch.
+ Lật ựĩa thạch, gói trong giấy báo, nuôi ở nhiệt ựộ phòng từ 3-7 ngày.
+ Tách các khuẩn lạc riêng rẽ, cấy chuyển cho ựến khi ựạt ựộ thuần khiết thì cấy chuyền sang ống thạch nghiêng ựể bảo quản và nghiên cứu các ựặc ựiểm khác nhau.
3.4.2.2. Phương pháp xác ựịnh hoạt tắnh enzym ngoại bào của Bacillus, xạ khuẩn và nấm Trichorderma sp.
- Phương pháp: khuếch tán trên thạch bằng cách khoan lỗ, nhỏ dịch nuôi nấm vào các lỗ khoan trên ựĩa thạch có chứa 1% cơ chất.
- Tiến hành:
+ Chuẩn bị dịch enzym :Các chủng vi sinh vật ựược nuôi cấy trong môi trường dịch thể trên máy lắc 2 ngày ựối với Bacillus và 4 ngày ựối với xạ khuẩn với tốc ựộ 200 vòng/phút. Chủng Trichorderma nuôi trên môi trường thạch rồi thu bào tử sau ựó cho vào ống nghiệm chứa nước cất
+ Sau ựó ựem ly tâm phần dịch thể với tốc ựộ 5000vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt ựộ 25oC rồi dùng pipet hút phần dịch trong ựó vào các lỗ khoan trên thạch có chứa 1% cơ chất.
+ Ủ ở ựiều kiện 28-30 oC trong 24h.
+ Nhỏ thuốc thử ựể xác ựịnh khả năng phân giải (protease bằng thuốc thử HgCl2; amylase, cellulase bằng thuốc thử lugol) và ựo vòng phân giải.
- Chỉ tiêu theo dõi: Vòng phân giải=D Ờ d (mm)
Trong ựó: D là ựường kắnh vòng phân giải d là ựường kắnh của lỗ khoan
D Ờ d ≥ 25: rất mạnh D Ờ d ≥ 20: mạnh D Ờ d ≥ 10: trung bình D Ờ d < 10: yếu
3.4. 2.3.Phương pháp hóa sinh:
- Phương pháp xác ựịnh OC%: Walkley và Black
- Phương pháp Kjeldhal xác ựịnh %N tổng số: phá bằng H2SO4 và xúc tác - Phương pháp so màu xác ựịnh %P2 O5 tổng số: công phá bằng H2SO4 + HClO4
- Phương pháp xác ựịnh % K2O tổng số: ựo bằng quang kế ngọn lửa, phá mẫu bằng HF + HClO4
3.4.2.4.Phương pháp xử lý số liệu:
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN