1. Nguyên liệu, dụng cụ và hoá chất
+ Ngun liệu : Mẫu cây để ni cấy (cành hoa hồng, hoa cúc, cẩm chướng, mầm khoai tây, khoai lang)
+ Dụng cụ : Phịng ni cấy mơ với đầy ñủ các dụng cụ cho kỹ thuật nuôi cấy in vitro + Hoá chất : Các loại hoá chất trong thành phần mơi trường Murashige- Skoog (1968), agar, đường sacaroza
2. Nguyên lý của phương pháp :
Tế bào có tính tồn năng, tính phân hố và phản phân hoá nên bất cứ một tế bào nào cũng có thể hình thành một cây hồn chỉnh và đó cũng chính là cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào (in vitro) và kỹ thuật nhân giống vơ tính (nhân bản). Người ta có thể biến một tế bào bất kỳ (hoặc một mẩu mơ) thành một cơ thể hồn chỉnh khi được ni cấy trong mơi trường thích hợp có đầy ñủ các ñiều kiện cần thiết cho tế bào thực hiện các q trình phân hóa, phản phân hố
Kỹ thuật nhân giống vơ tính in vitro gồm các bước:
- Chuẩn bị mẫu cấy và mơi trường ni cấy: u cầu mẫu hồn tồn sạch vi sinh vật, mơi trường đầy đủ thành phần và sạch vi sinh vật
- Khởi ñộng mẫu in vitro : yêu cầu có chồi in vitro cao 1-2 cm, chồi khoẻ - Nhân nhanh chồi in vitro : yêu cầu có hệ số nhân chồi cao, chồi khoẻ - Tạo cây hoàn chỉnh : yêu cầu cây hoàn chỉnh cáo bộ rễ tốt
- Ra cây trong vườn ươm : yêu cầu tỷ lệ sống cao, cây khoẻ
3. Cách tiến hành
• Bước 1 : chuẩn bị mẫu và môi trường nuôi cấy
- Chuẩn bị mẫu cấy : Lựa chọn mẫu cây có trạng thái sinh trưởng tốt, khơng bị bệnh. Kết quả giai đoạn này phụ thuộc rất nhiều vào cách lấy mẫu, tuỳ thuộc vào mục đích khác nhau, loại cây khác nhau để lấy mẫu nuôi cấy phù hợp . Thường chọn mơ non (ít chun hố - đỉnh chồi, mắt ngủ, lá non, vảy củ...)
Cần thiết phải khử trùng mẫu trước khi ni cấy để loại bỏ các vi sinh vật (nấm, khuẩn...) bám trên bề mặt mẫu cấy bằng hoá chất khử trùng, thường dùng các chất: HgCl2 0,1% xử lý trong 5-10 phút, NaOCl, Ca(OCl)2 5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H2O2, dung dịch Br... Các thao tác khử trùng tiến hành trong buồng cấy vô trùng.
- Chuẩn bị môi trường ni cấy
- Cân đúng lượng hố chất trong thành phần mơi trường MS (Murashige- Skoog, 1968), thường được lấy từ dung dịch "mẹ" pha trước ñược bảo quản trong tủ lạnh
- Ðun mơi trường, rót vào các bình hoặc ống nghiệm, đậy nắp và khử trùng trong nồi hấp với chếñộ 121oC (tương ứng1 atm) trong 20 phút)
Bảng thành phần môi trường MS
STT Nhóm Tên hố chất Dung dịch mẹ Dung dịch
nuôi Ghi chú 1 NH4NO3 33,0 g/lit 2 KNO3 38,0 g/l 3 MgSO4.7H2O 7,4 g/l 4 ða lượng KH2PO4 3,4 g/l
lấy 50 ml/lit Pha chung
5 CaCl2 . 2H2O 8,8 g/l Lấy 50 ml/lit Pha riêng
6 H3BO3 620 mg 7 MnSO4 . 4H2O 2230 mg 8 ZnSO4 . 7H2O 860 mg 9 KI 83 mg 10 CuSO4. 5H2O 2,5 mg 11 MoO4Na2H2O 25 mg 12 Vi lượng CoCl26H2O 2,5 mg
Lấy 10 ml/lit Pha chung
13 Fe SO4 . 7H2O 5,56 g/l
14 Sắt Na2EDTA 7,46 g/l
Lấy 5 ml/lit Pha chung
15 A xit nicotinic 100 mg Lấy 5ml/lit Pha riêng
16 Thiamin HCl 200 mg Pha riêng
17 Py ridoxin 100 mg Pha riêng
18
Vitamin
I no sitol 100 mg/lit Pha riêng
• Bước 2 : Khởi động mẫu cấy in vitro
-Câý mẫu đã khử trùng vào bình hoặc ống nghiệm có mơi trường ni cây. Các thao tác cấy tiến hành trong buồng cấy vơ trùng trên ngọn lửa đèn cồn. Các dụng cụ sử dụng ñể cấy (panh, dao, kéo...) đều vơ trùng
-Chuyển bình mẫu cây sang phịng ni cây (có ánh sáng hoặc khơng tuỳ thuộc từ mục đích khởi động chồi hay khởi động callus...)
Theo dõi sự tạo chồi từ mẫu cấy ban đầu • Bước 3 : nhân nhanh
- Giai ñoạn này cần phát sinh số lượng lớn chồi trên một ñơn vị mẫu cấy trong một thời gian nhất ñịnh. Ðơn vị mẫu cấy có thể tính theo số chồi cấy ban ñầu, sốñốt cấy ban ñầu, số protocom ban ñầu, ...Tức là có hệ số nhân giống lớn nhất.
- Cấy chuyển mẫu khởi động sang mơi trường nhân nhanh. Thành phần dinh dưỡng của môi trường giống như môi trường khởi ñộng nhưng cần bổ sung chất ñiều tiết sinh trưởng, đặc biệt các tác nhân phân hố chồi như nhóm chất xytokinin.
Theo dõi sự phát sinh chồi, tính hệ số nhân chồi. • Bước 4 : Tạo cây hồn chỉnh
Kết thúc giai đoạn nhân cây chúng ta có được số lượng lớn chồi nhưng chưa hình thành cây hồn chỉnh vì chưa có bộ rễ cây. Vì vậy, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ, cần tách các chồi riêng cấy chuyển vào mơi trường ni cấy bổ sung chất điều tiết sinh trưởng nhóm auxin. Mỗi chồi khi ra rễ là thành một cây hồn chỉnh.
Một số loại cây có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trường không chứa chất ñiều tiết sinh trưởng.
• Bước 5 : Ra cây ngồi điều kiện tự nhiên.
Khi cây trong ống nghiệm ñã ñủ tiêu chuẩn (về chiều cao, số lá, số rễ), ñược chuyển ra trồng ngồi điều kiện tự nhiên. Trước khi trồng ngồi đất, cây trong ống nghiệm thường ñược chuyển ra trồng vào giá thể xốp nhẹ (trấu hun, xơ dừa...) ñặt trong nhà lưới có điều chỉnh ánh sáng, độẩm thích hợp cho cây thích nghi dần với mơi trường tự nhiên. Sau một thời gian cây con cứng cáp sẽñược trồng ra ñất.
Cách thực hiện : Mỗi nhóm thực hiện mỗi bước trong quy trình (cửđại diện thực hiện). Theo dõi ghi chép kết quả : tỷ lệ mẫu không nhiễm, tỷ lệ mẫu bật chồi, hệ số nhân, tỷ lệ ra rễ, tỷ lệ cây sống ngoài vườn ươm,...
4. Trả lời câu hỏi và rút ra kết luận
+ Trình bày tóm tắt các bước trong kỹ thuật ni cấy in vitro và yêu cầu từng bước + Trình bày kết quả theo dõi của các nhóm :
Nhóm 1: chuẩn bị mẫu cấy, khởi động mẫu in vitro (mơi trường ni cấy được chuẩn bị sẵn)
Mẫu nhiễm Mẫu sạch Mẫu bật chồi Loại cây Tổng số mẫu cấy Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ % Cúc H.hồng ..... Nhóm 2: Nhân nhanh Loại cây Số chồi cấy Số chồi phát sinh (hoặc sốđốt) Hệ số nhân (Lần/tuần) Cúc H.hồng ..... Nhóm 3: Tạo cây hoàn chỉnh Loại cây Số chồi cấy Số chồi ra rễ Tỷ lệ ra rễ (%) Cúc H.hồng ..... Nhóm 4: Ra cây
Loại cây Số cây trồng Số cây sống Tỷ lệ sống (%) Cúc
H.hồng .....
Thí nghiệm 2: Xác định hệ số nhân giống vơ tính in vitro của một số loại cây trồng
1. Nguyên liệu, dụng cụ
+ Nguyên liệu : các mẫu cây trồng ñược nhân trong ống nghiệm : dâu tây, khoai lang, khoai tây, chuối, dứa, phong lan, cúc, cẩm chướng...
+ Dụng cụ : bút, sổ ghi chép, kính lúp cầm tay
2. Nguyên lý của phương pháp :
Nhân giống vơ tính nhân tạo là hình thức có sự tác động của các biện pháp cơ học, hố học, cơng nghệ sinh học... ñểñiều khiển sự phát sinh các cơ quan bộ phận của cây như rễ,
chồi, lá... hình thành một cây hồn chỉnh hồn tồn có khả năng sống ñộc lập với cây mẹ. Cây ñược hình thành bằng phương thức nhân giống vơ tính có đặc tính di truyền của cây mẹ.
Có hai loại :
-Nhân giống vơ tính nhân tạo ñược thực hiện trong ñiều kiện tự nhiên (in vivo) (Macropropagation)
-Nhân giống vơ tính nhân tạo được thực hiện trong phịng thí nghiệm (in vitro (Micropropagation).
Trong thí nghiệm này chúng ta tìm hiểu về nhân giống vơ tính nhân tạo in vitro . Tế bào có tính tồn năng, tính phân hố và phản phân hoá nên bất cứ một tế bào nào cũng có thể hình thành một cây hồn chỉnh và đó cũng chính là cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào (in vitro) và kỹ thuật nhân giống vơ tính (nhân bản). Người ta có thể biến một tế bào bất kỳ (hoặc một mẩu mô) thành một cơ thể hồn chỉnh khi được ni cấy trong mơi trường thích hợp có đầy đủ các điều kiện cần thiết cho tế bào thực hiện các quá trình phân hóa, phản phân hố
Dựa vào số cơ quan dinh dưỡng có thể hình thành nên cơ thể mới để tính hệ số nhân trên ñơn vị cây mẹ và trong một đơn vị thời gian. Theo cơng thức :
Hệ số nhân (lần/ngày) = tổng số cơ quan dinh dưỡng (chồi , củ, nhánh....) mới phát sinh / tổng số cơ quan dinh dưỡng ban ñầu (chồi, củ, nhánh...) / tổng số ngày
3. Cách tiến hành : Dùng kính lúp cầm tay soi và ñếm cẩn thận số cơ quan dinh dưỡng mới phát sinh trong mỗi bình cây. Mỗi bình đếm 3 lần lấy số trung bình. Từ đó tính ra hệ số nhân theo cơng thức trên.
4. Trả lời câu hỏi và rút ra kết luận
a. Xác ñịnh hệ số nhân của các loại cây trồng trong thí nghiệm và rút ra nhận xét về khả năng nhân giống của từng loại cây trồng trong ñiều kiện in vitro
b. Phân loại kiểu nhân giống vơ tính trong điều kiện in vitro của từng loại cây trồng (chồi nách, chồi bất ñịnh)
c. Vẽ các dạng nhân giống vơ tính quan sát được trong thí nghiệm.
BÀI 3
NGHIÊN CỨU VỀ TRAO ðỔI NƯỚC CỦA CÂY
Thí nghiệm1. Xác định nhu cầu nước của cây thơng qua cường độ thốt hơi nước:
1. Nguyên lý của phương pháp
Phương pháp này dựa trên cơ sởcường ñộ thoát hơi nước càng lớn, lượng nước bay ñi qua bề mặt lá càng nhiều. Ðiều đó chứng tỏ các hoạt ñộng sống, hoạt ñộng trao ñổi chất của cây càng mạnh, nhu cầu nước của cây càng cao.
Thông qua cường độ thốt hơi nước biết ñược nhu cầu nước của cây, vì hầu hết lượng nước hút vào ñều bay hơi ñi (99,2 - 99,9%), qua đó tính được lượng nước cây cần để có chế độ tưới nước hợp lý cho từng loại cây trồng.
Cường độ thốt hơi nước ñược tính bằng lượng nước bay hơi đi (gam hoặc kilogam) trên một đơn vị diện tích lá (dm2 hoặc m2) trong một ñơn vị thời gian (phút hay giờ).
Số g nước bay hơi ñi
ITHN = ------------------------------- (g/m2 lá/giờ) S lá x Thời gian
2. Nguyên vật liệu thí nghiệm:
- Mẫu thực vật: các cành cây có lá hoặc cả cây cịn nhỏ (lúa, ngơ, khoai tây, ñậu, lạc v.v).
- Dụng cụ: Hệ thống bình thơng nhau gồm: bình trụ chia độ (hoặc biuret chia độ có nắp (bằng nhựa hoặc bọt xốp đậy kín, bình trồng cây, phễu; giá ñỡ; ñồng hồ bấm giây; giấy, thước kẻ, cân ñiện (hoặc cân kỹ thuật).
- Paraphin, nước sạch.
3. Cách tiến hành:
Thiết kế hệ thống thí nghiệm (theo hình vẽ bên) sao cho tối thiểu 2/3 chiều dài rễ cây ñược ngập trong nước ñể hút nước thuận lợi.
Cho cây con hoặc cành cây thí nghiệm qua lỗ khoan của nắp bình (lưu ý: nên gắn paraphin để tránh nước bay hơi qua các khe hở của hệ thồng bình và biuret). Rót nước qua phễu vào bình (hoặc biurét). Ghi nhận mực nước ban đầu ở bình trụ (hoặc biurét).
Ðể cây thực hiện thoát hơi nước. Sau thời gian 1 giờ (hoặc tối thiểu 30 phút) xác ñịnh mực nước trên vạch chia độđể tính ra lượng nước hao hụt do thốt hơi nước của cây (hoặc cành cây).
Xác ñịnh diện tích lá bằng phương pháp cân (trực tiếp hoặ gián tiếp) rồi tính cường độ thốt hơi nước. Lặp lại thí nghiệm 3 lần rồi lấy giá trị trung bình.
Tiến hành thí nghiệm trong nhiều điều kiện khí hậu, thời tiết khác nhau (có nắng hoặc khơ hanh, có gió hoặc khơng có gió v.v), trên nhiều loại cây khác nhau để có thể so sánh, ñánh giá nhu cầu nước của các cây trong các điều kiện khác nhau.
Thí nghiệm 2. Xác ñịnh nhu cầu nước và thời ñiểm tưới của cây thơng qua độ thiếu hụt bão hồ nước.
1. Ngun lý của phương pháp
Ðộ thiếu hụt bão hoà nước là lượng nước cây cần ñược bổ sung để đạt trạng thái bão hồ hồn toàn. Ðây là một chỉ tiêu quan trọng chi phối tất cả các hoạt ñộng sinh lý của lá, cây.. Nếu ñộ thiếu hụt nằm trong khoảng 5 - 10% tức là mọi hoạt ñộng sống của cây ñang diễn ra thuận lợi; nếu thấp hơn 10% vẫn được coi là bình thường, chưa gây hại cho cây. Nhưng, nếu chỉ số này bằng hoặc vượt quá 25 % thì lá cây bị héo, chứng tỏ cây ñạng bị thiếu nước, các hoạt ñộng sống ñã bị vi phạm nghiêm trọng, cây ñang rất cần nước.
Ðộ thiếu hụt bão hồ nước được biểu thị bằng % so với lượng nước bão hào hồn tồn của lá cây và được đo bằng hiệu số giữa lượng nước bão hoà và lượng nước tại thời ñiểm xác ñịnh so với tỷ lệ % của tổng lượng nước trong mơ ở trạng thái bão hịa. Ðộ thiếu hụt bão hồ được tính bằng cơng thức:
w2 - w1
ÐTHBHN (%) = . 100
w2 - wk
Trong đó: w2 - Khối lượng tươi của cây khi bão hoà nước hoàn toàn w1 - Khối lượng tươi của cây tại thời ñiểm xác ñịnh wk - Khối lượng khơ của cây (độ khơ khơng ñổi)
Ðộ thiếu hụt bão hoà nước nhỏ tức là cây mất ít nước - cây dễ dàng khơi phục trạng thái bão hồ nước gọi là độ thiếu hụt bão hoà tới hạn. Ðộ thiếu hụt bão hoà nước lớn cây mất cân bằng nước, héo rũ. Nếu duy trì lâu cây sẽ chết gọi là độ thiếu hụt bão hoà gây chết.
2. Nguyên vật liệu thí nghiệm:
- Mẫu thực vật: Lá cây thí nghiệm các cành cây có lá hoặc cả cây cịn nhỏ (lúa, ngơ, khoai tây, ñậu, lạc v.v).
- Dụng cụ: kéo cắt lá cây, cân kỹ thuật, tủ sấy, dụng cụđể tạo độẩm bão hồ cho lá (khay có mút giữ nước).
3. Cách tiến hành:
Cắt lá khỏi cây (nếu lá q to, q dài thì có thể cắt thành mảnh nhỏ hơn) rồi mang cân, xác ñịnh khối lượng tươi (W1) ngay tại thời điểm thí nghiệm. Ðặt lá vào dụng cụ gây bão hồ nước, đậy nắp ñể hạn chế bay hơi nước). Sau thời gian từ 1-3 giờ (tuỳ loại lá, loại cây) lá ñạt trạng thái bão hoà nước hoàn toàn. Cân toàn bộ số lá đó để xác định W2. Sấy khơ lá ở nhiệt độ 80 - 100oC, sau đó nâng nhiệt ñộ lên 105oC ñể lá ñạt độ khơ tuyệt ñối (ñộ khô không ñổi). Cân ñể xác ñịnh khối lượng khô (Wk). Tính độ thiếu hụt bão hồ nước theo cơng thức đã cho.
Làm thí nghiệm với nhiều loại cây trồng khác nhau và so sánh các kết quả. Ðánh giá mức ñộ thiếu bão hoà nước của các loại cây khác nhau và cho biết ở thời điểm đó, các cây thí nghiệm đã cần được tưới nước chưa. Giải thích tại sao!
BÀI 4
NGHIÊN CỨU VỀ DINH DƯỠNG KHOÁNG CỦA CÂY
Thí nghiệm 1. Nghiên cứu vai trị của các nguyên tố khoáng
Các cây trồng khác nhau có nhu cầu khác nhau về hàm lượng, thành phần dinh dưỡng. Mỗi yếu tố dinh dưỡng có vai trị rất khác nhau đối với các hoạt động sống của cây. Thậm chí, trên cùng một ñối tượng cây trồng nhưng ở ñiều kiện sinh thái khác nhau tác dụng của chúng cũng thể hiện rất khác nhau tuỳ thuộc vào hàm lượng và cách tác động. Muốn nghiên cứu, tìm hiểu vai trị của từng thành phần dinh dưỡng, liều lượng sử dụng có hiệu quả nhất thì phương pháp hữu hiệu là trồng cây trong các điều kiện khác nhau.
Có nhiều phương pháp trồng cây thí nghiệm như: trồng trong dung dịch, trồng trong chậu cát, trồng trong chậu đất, trồng trong ơ xây, trồng trên ñồng ruộng. Mỗi phương pháp trồng cây đều có ưu, nhược điểm nhất ñịnh và ñược sử dụng trong những ñiều kiện nhất