ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.3. Phương pháp gây tạo đột biến in vitro
Phương pháp gây tạo đột biến được tiến hành theo quy trình của Novak và Brunner (1992) có cải tiến như sau:
* Phương pháp xử lý gây tạo đột biến bằng hóa chất EMS
vitro cây cẩm chướng giống Quận Chúa được đưa vào nuôi cấy trên môi trường MS (cấy 1.500 mẫu). Sau thời gian một tháng, lựa chọn các chồi sinh trưởng phát triển tốt, đồng đều nhau, hình thái thân lá bình thường, cắt đoạn thân ra thành các đoạn mang mắt ngủ có độ dài khoảng 1,0 cm (chỉ lấy các đoạn ở giữa).
- Xử lý tác nhân gây tạo đột biến: Lựa chọn mẫu đồng đều nhau đem ngâm vào bình chứa dung dịch EMS được pha theo nồng độ đã định. Mỗi công thức xử lý 60 mẫu cho một lần nhắc lại, tiến hành 3 lần nhắc lại. (Dung dịch EMS pha sau khi đã chuẩn bị mẫu xong để hạn chế sự thủy phân làm giảm hiệu quả). Sau đó đưa các bình này vào máy lắc đặt trong bóng tối với các mức thời gian khác nhau. Các mẫu sau khi xử lý đem rửa bằng nước cất vô trùng 5 lần sau đó đặt vào các đĩa petri có lót giấy thấm đã được khử trùng. Sau khi được làm sạch các mẫu được nuôi cấy trên môi trường nhân nhanh chồi (MS bổ sung 6,5 g/l agar, 30 g/l saccarose, 100 mg/l innositol và 1,0 mg/l kinetin), theo dõi, đo đếm các chỉ tiêu.
- Phân lập các dạng chồi biến dị về mặt hình thái: việc phân lập các dạng chồi sau xử lý ở giai đoạn nuôi cấy in vitro dựa trên đặc điểm hình thái thân, lá của các dạng chồi.
- Nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh các dạng chồi phân lập: Các dạng chồi đã được phân lập được nhân nhanh qua 5 thế hệ (M1V5), sau đó đưa vào nuôi cấy trong môi trường tạo rễ (MS bổ sung 6,5 g/l agar, 30 g/l saccarose, 100 mg/l innositol, 0,5 g/l than hoạt tính và 0,25 mg/l α-NAA).
- Thích ứng cây ngoài vườn ươm: Để tăng khả năng sống của các cây in vitro, khi cây đạt tiêu chuẩn, được đưa ra thích ứng ngoài vườn ươm, trồng trên hệ thống khí canh sử dụng dung dịch Anthura với chu kỳ phun 15 phút/1 lần, mỗi lần phun 15 giây (Nguyễn Thị Lý Anh và cs., 2010).
- Trồng cây ra giá thể: Cây trồng trong điều kiện khí canh sau 2 tuần được đưa xuống trồng trong các khay nhựa chứa giá thể đất + trấu hun (theo tỷ lệ 1:1).
- Phân lập các dạng biến dị ngoài đồng ruộng: Sau 2 tuần trồng trong giá thể cây được đưa ra trồng trong nhà lưới có mái che. Thực hiện trồng và chăm sóc theo quy trình trồng hoa cẩm chướng của Viện nghiên cứu Rau quả. Theo dõi đo đếm các chỉ tiêu, phân lập các dạng biến dị ngoài đồng ruộng. Để hạn chế thể khảm
tiến hành theo dõi hoa của các chồi phía dưới. Nếu hoa có sự khác nhau tiến hành tách chồi đưa vào nuôi cấy in vitro. Sau đó tạo cây hoàn chỉnh và đưa ra trồng ngoài đồng ruộng, theo dõi sự biểu hiện về các đặc điểm so với lần trồng đầu.
- Đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng đột biến được lựa chọn: Lựa chọn các dòng đột biến có tiểm năng để đánh giá sự sai khác về di truyền ở mức độ phân tử bằng chỉ thị SSR.
* Phương pháp xử lý chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co:
- Chuẩn bị nguồn vật liệu để xử lý: như phương pháp xử lý bằng EMS - Xử lý tác nhân gây tạo đột biến: các đoạn thân được cắt thành từng đoạn nhỏ dài 1,0 cm mang một mắt ngủ được cấy trên môi trường MS trong các đĩa petri với số lượng 60 mẫu/ đĩa. Mỗi công thức xử lý 180 mẫu chia thành 3 lần nhắc lại. Sau đó mẫu được đem đi chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co với liều lượng đã định tại Bệnh viện K Hà Nội. Sau khi xử lý xong mẫu được cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh (MS bổ sung 6,5 g/l agar, 30 g/l saccarose, 100 mg/l innositol và 1,0 mg/l kinetin).
Các bước tiếp theo tiến hành như phương pháp xử lý EMS
* Phương pháp xử lý đột biến kết hợp hóa chất EMS và chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co
- Chuẩn bị nguồn vật liệu để xử lý: như phương pháp xử lý bằng EMS và xử lý chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co.
- Xử lý tác nhân gây tạo đột biến: Lựa chọn mẫu đồng đều nhau đem ngâm vào bình chứa dung dịch EMS được pha theo nồng độ đã định. Mỗi công thức xử lý 60 mẫu cho một lần nhắc lại, tiến hành 3 lần nhắc lại. Sau đó đưa các bình này vào máy lắc đặt trong bóng tối với thời gian 2 giờ. Các mẫu sau khi xử lý đem rửa bằng nước cất vô trùng 5 lần sau đó đặt vào các đĩa petri có lót giấy thấm đã được khử trùng. Sau khi được làm sạch các mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS trong các đĩa petri. Sau đó mẫu được đem đi chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co với liều lượng đã định tại Bệnh viện K Hà Nội. Mẫu sau xử lý được cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh (MS bổ sung 6,5 g/l agar, 30 g/l saccarose, 100 mg/l innositol và 1,0 mg/l kinetin).
Các bước tiếp theo tiến hành như phương pháp xử lý bằng EMS và chiếu xạ tia gamma nguồn 60Coriêng rẽ.
Xác định nồng độ EMS và liều lượng xử lý tia gamma nguồn 60Co tối ưu dựa trên các tiêu chí: tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ chồi biến dị cao; số chồi biến dị nhiều và có nhiều dạng chồi có tiềm năng (sinh trưởng phát triển tốt, xuất hiện nhiều biến dị có lợi,…).