Các tác nhân gây đột biến có thể là các nhân tố sinh học, hoá học và vật lý. Các nhân tố này có thể làm gia tăng tần số đột biến lên 10 đến 100 nghìn lần. Các loại tác nhân thường dùng bao gồm:
- Tác nhân hóa học: bao gồm các chất như DES, EMS, EI, NEU, NMU, NaM3, 1,4- Biadiazo - acetyl Butane, ...
- Tác nhân vật lý: tia X (từ đèn UV), phóng xạ điện từ (tia X từ máy X - quang, tia gamma từ nguồn 60Co và 137Cs, phóng xạ hạt (chùm neutron nóng hoặc chậm từ lò phản ứng, chùm neutron nhanh từ lò phản ứng, các hạt beta phóng ra từ 32P và 35S), ion beam và electron beam.
Theo thống kê của tổ chức Năng lượng nguyên tử quốc tế (IAEA) năm 2008, tại Nhật Bản nếu chỉ tính riêng trong lĩnh vực tạo giống mới bằng các tác nhân đột biến khác nhau thì đóng góp của các tác nhân bức xạ chiếm đến 77,7%. Trong đó, tia gamma là tác nhân có đóng góp lớn nhất trong phương pháp tạo giống đột biến, chiếm 60,3%, tiếp theo phương pháp gây tạo đột biến bằng nuôi cấy in vitro đóng góp 15,7 %, sau đó là tia X chiếm 9,5%. Tác nhân hóa học mặc dù được sử dụng từ rất lâu nhưng tỷ lệ đóng góp chỉ khoảng 6,6% trong khi đó tia ion mới được sử dụng gần đây nhưng đã đóng góp tỷ lệ 5,8% (Nakagawa, 2008).
Trên thế giới năm 2009, tỷ lệ đóng góp của tác nhân vật lý chiếm 87%, tác nhân hóa học chiếm 13% (FAO và IAEA, 2009).
Hình 1.2. Tỷ lệ đóng góp của các tác nhân trong đột biến tạo giống cây trồng tạiNhật Bản năm 2008
(Nguồn: Nakagawa, 2008)
Theo một số tài liệu thì tác nhân gây đột biến hoá học có hiệu quả hơn tác nhân vật lý. Nếu dưới ảnh hưởng của chiếu xạ ở các cây nông nghiệp xuất hiện 10 - 15% biến đổi di truyền có khả năng sống thì tác nhân hoá học cho phép thu nhận từ 30 - 60%. Hơn nữa tác nhân gây đột biến hoá học thường làm xuất hiện những biến dị đặc biệt hơn (Đào Thị Thanh Bằng và cs.,1997).
1.4.2.1. EMS và ứng dụng EMS trong công tác chọn tạo giống cây trồng
EMS - Methylethane sulphonate, công thức hoá học: CH3SO2OC2H5, khối lượng phân tử 124,16 gmol-1, tỷ trọng 1,1452 (220C), Điểm nóng chảy < 250C, Điểm sôi 213 - 213,50C.
EMS có thể gây đột biến ít nhất bằng 3 cách: thêm nhóm methyl (- CH3) hay ethyl (- C2H5) vào guanine tạo base đồng đẳng của adenine dẫn đến bắt cặp bổ sung sai; làm mất guanine do đã bị alkyl hoá (mất purine) tạo lỗ hổng trên DNA, khi sao chép có thể làm đứt mạch; liên kết chéo giữa các mạch của một hoặc các
Tia ion 5,80% Tia X 9,50% Tác nhân hóa học 6,60% Nuôi cấy in vitro 15,70% Tia gamma 60,30% Tia bức xạ khác 2,10%
phân tử DNA khác nhau làm mất nucleotide.
Trong các tác nhân gây đột biến bằng hoá học, EMS là chất được sử dụng phổ biến và cho hiệu quả cao (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007). Dung dịch hoá chất gây đột biến này phải được chuẩn bị trước khi dùng và nó được tồn trữ như dung dịch gốc. Tốc độ thuỷ phân của hợp chất này được đo bằng phương pháp bán thời gian (hafl life). Qua các kết quả nghiên cứu cho thấy tốc độ thuỷ phân của EMS phụ thuộc rất lớn vào nhiệt độ. Trong nước cất (pH = 7) ở nhiệt độ 200C, hafl life của EMS là 93 giờ, ở 300C là 26 giờ và ở 370C là 10 giờ (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2007). Vì vậy, để đảm bảo hoạt tính của chất gây đột biến chỉ nên chuẩn bị dung dịch trước khi xử lý không quá 30 phút và giữ trong bóng tối trong suốt thời gian xử lý (Đào Thị Thanh Bằng và cs., 1997)
Người ta còn phát hiện rằng dimethylsulphoxide (DMSO) là một chất mang có chức năng thúc đẩy hiện tượng phát sinh đột biến gen của EMS. Xử lý chất này làm giảm sự sinh trưởng 30 - 40% có khả năng tạo nên đột biến ở tần suất tối hảo cho cây trồng thuộc nhóm mễ cốc (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007).
Để gây đột biến cho cây trồng có thể xử lý hoá chất EMS trên các bộ phận như hạt, chồi, củ, phôi trong thời gian đang phát triển. Tuy nhiên, đối với mỗi giống, bộ phận của cây trồng có sự cảm ứng khác nhau với hoá chất gây đột biến. Các kết quả nghiên cứu cho thấy, khi tăng nồng độ của tác nhân đến mức độ nhất định thì khả năng sống của cây cũng tăng, sau đó nếu tiếp tục tăng thì khả năng sống của đối tượng lại giảm xuống. Vì vậy, đối với từng giống, từng bộ phận cây trồng cần phải xác định nồng độ, thời gian tác động hợp lý mới có thể đem lại hiệu quả gây đột biến di truyền cao.
1.4.2.2. Đột biến phóng xạ và ứng dụng trong công tác chọn tạo giống cây trồng
Tia gamma và tia X là 2 tác nhân chiếu xạ cơ bản trong gây tạo đột biến thực nghiệm. Được dùng phổ biến nhất là tia gamma với nguồn 60Co và 137Cs do có bước sóng rất ngắn và vận tốc rất lớn, không có khối lượng và điện tích, không bị lệch trong điện trường và có sức xuyên khá lớn.
Cơ chế gây đột biến của tác nhân phóng xạ
gồm 3 giai đoạn chính:
- Giai đoạn 1: Có tính chất vật lý, sự tương tác của các bức xạ tạo ra các quá trình ion hoá và sự biến đổi các hợp chất ở mức phân tử và dưới phân tử.
- Giai đoạn 2: Có tính chất hoá học, giai đoạn này diễn ra các phản ứng tương tác của các sản phẩm sơ cấp do kết quả tương tác của bức xạ với các đại phân tử chưa bị biến tính của các cấu trúc sinh học, tạo ra các peoxit hữu cơ đồng thời diễn ra các phản ứng oxi hoá dẫn tới sự tạo thành các hợp chất mới.
- Giai đoạn 3: Có tính chất sinh học, là giai đoạn phát huy tác dụng của các phản ứng lên hoạt động của các tế bào sống. Tức là các biến đổi hoá học gây nên do bức xạ dưới mức tế bào, chẳng hạn như làm thay đổi cấu trúc và tính thấm của màng tế bào.
Quá trình tác động qua nhiều giai đoạn như trên gọi là tác động gián tiếp của bức xạ lên tế bào sống. Ngoài ra các nghiên cứu cho thấy các tia bức xạ còn gây ra tác động trực tiếp lên một số cấu trúc dưới tế bào, gây ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình tổng hợp DNA và tổng hợp protit trong tế bào sống, đặc biệt là các biến đổi trong cấu trúc DNA, làm phát sinh đột biến di truyền (Phạm Thành Hổ, 2010).
Quá trình phát sinh đột biến cảm ứng rất phức tạp, liên quan và phụ thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý học của loại tia phóng xạ; liều lượng, cường độ phóng xạ; sự phục hồi các biến dị tiềm năng và các yếu tố khác như: dưỡng khí, nhiệt độ, lượng nước trong mô, một số chất hoạt hoá, điều kiện sinh thái, giai đoạn phát triển, kiểu gen của vật liệu xử lý.
Để tạo ra các giống cây đột biến bằng công nghệ này, tùy theo từng đối tượng cây trồng người ta có thể chiếu xạ trực tiếp các bộ phận của cây như mầm, chồi, hạt phấn, nhụy, hạt giống hay toàn bộ cây ở những giai đoạn khác nhau. Bên cạnh đó có thể kết hợp chiếu xạ với phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để tạo callus, PLB,... sau đó chiếu xạ (Chakrabarty and Datta, 2010). Tùy vào liều lượng và thời gian xử lý chiếu xạ sẽ tạo ra những đứt gẫy nhiễm thể hoặc những thay đổi về cấu trúc gene. Những mẫu sau khi chiếu xạ có thể được gieo trồng trực tiếp hoặc được nhân lên và tái sinh cây in vitro. Sau đó trồng ra ngoài đồng ruộng và đánh giá, chọn lọc qua nhiều thế hệ. Những dòng, giống ưu việt sẽ được nhân lên để sản xuất đại trà.