CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, dụng cụ, hóa chất
2.1.1. Thu gom nguyên liệu
-Cây ngải cứu được thu hái từ xã Hòa Long, Thành Phố Bà Rịa, Tỉnh Bà Rịa – Vũng
Tàu.
Hình 2.1. Cây ngải cứu 2.1.2. Dụng cụ - thiết bị và hóa chất 2.1.2. Dụng cụ - thiết bị và hóa chất
a. Thiết bị - Dụng cụ
Bảng 2. 1 Bảng danh sách thiết bị
Thiết bị Sốlượng Thiết bị Sốlượng
Máy xay 1 Cân phân tích (0.0001g) 1 Tủ sấy 1 Bếp điện bình cầu 1 Lị nung 1 Máy sắc kí khối phổ 1 Máy cơ quay chân không 1 Nồi hấp khử trùng 1
Bảng 2. 2 Bảng danh sách dụng cụ
Dụng cụ Sốlượng Dụng cụ Sốlượng
Bộ soxhlet 1 Cốc sứ 5 Bình cầu hai cổ 500ml 1 Đĩa petri 18 Bình cầu hai cổ 250 ml 1 Que cấy đầu nhọn 3 Nhiệt kế 1 Đèn cồn 1
Đũa thủy tinh 1 Que cấy đầu tròn 1
Muỗng inox 1 Que trang 1 Pipet (10ml, 5ml, 2ml) 3 Ống đong 500ml 1 Bóp cao su 1 Ống đong 250ml 1 Erlen 250 1 Cốc thủy tinh 250 2 Cốc thủy tinh 500 1
b. Hóa chất
- Cồn 96 - MHA - Dimethyl sulfoxit (DMSO) - MHB - Agar - Tetracylin - Ampicillin
2.1.3. Vi khuẩn thí nghiệm [21]
Các chủng vi khuẩn dùng trong thí nghiệm có nguồn gốc tại trường Đại học Công Nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh bao gồm: Chủng Staphylococcus aureus Chủng Escherichia coli Chủng Salmonella Spp Chủng Bacilus cereus Chủng Pseudomonas aeruginosa 2.1.4. Các phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu lý thuyết: nghiên cứu các hợp chất tự nhiên, tổng quan các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hóa học, ứng dụng của lá ngải cứu.
- Nghiên cứu chiết tách dịch chiết bằng phương pháp soxhlet với điều kiện khảo sát: tỉ lệ nguyên liệu/dung mơi và thời gian chiết.
- Nghiên cứu phân tích trọng lượng: độ ẩm, hàm lượng tro hóa.
- Nghiên cứu thành phần hóa học chính trong dịch chiết lá ngải cứu bằng phương pháp sắc ký khối phổ GC/MS.
- Thử hoạt tính sinh học của cao chiết lá ngải cứu trên chủng năm vi khuẩn.
2.2. Xử lý nguyên liệu
- Thu hái toàn bộ lá ngải cứu tươi, nhặt nhọn những lá tươi không sâu bệnh, nấm mốc. Đem
đi rửa sạch sau đó phơi nắng đến khô.
- Khi tiến hành chiết tách mới xay nhỏ nguyên liệu cho vào túi nhằm đảm bảo độ chính xác
hàm lượng dịch chiết ra.
Hình 2. 2 Cây ngải cứu sau khi thu hái
Hình 2. 4 Lá ngải cứu đã được phơi khơ2.3. Quy trình chiết tách dịch chiết lá ngải cứu [19] 2.3. Quy trình chiết tách dịch chiết lá ngải cứu [19]
2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu
Sơ đồ 2. 1 Quy trình cơng nghệ chiết cao lá ngải cứu
Dịch chiết Cao chiết Chiết bằng phương pháp soxhlet Lá ngải cứu đã xử lý(10g) Lá tươi rửa sạch,
phơi khô, xay nhuyễn
Xác định một số chỉ tiêu hóa lý: độ ẩm,
hàm lượng tro
Khảo sát điều kiện chiết: nguyên liệu/dung môi
với thời gian Cơ quay Đánh giá cảm quan Thử hoạt tính sinh học Xác định thành phần hóa học bằng phương pháp GC/MS
2.3.2. Thuyết minh quy trình
- Bước 1: Ngải cứu sau khi thu hái, nhặt phần lá tươi và khơng bị mốc, sâu bệnh. Sau đó
đem đi rửa sạch rồi phơi khơ. Xay nhuyễn rồi cân chính xác 10g (± 0,1g). Chuyển toàn
bộ nguyên liệu đã được chuẩn bị vào túi lọc (10 x 5 cm)
- Bước 2: Đong 250ml cồn cho vào bình cầu 2 cổ đem lắp vào hệ thống soxhlet. Đun duy
trì hệ thống trong 7 giờ với nhiệt độ 85C.
- Bước 3: Thu dịch chiết, đem đi cô quay chân không thời gian 40- 45 phút. Dịch sau cô
quay được cho vào lọ 5 – 10 ml, bịt kín bằng nút cao su và được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5C.
- Bước 4: Đem dịch chiết đi phân tích GC/MS đểđịnh danh các hợp chất và thử hoạt tính sinh học trên khuẩn Staphylococcus aureus, Escherichia coli , Salmonella Spp, Bacilus
cereus, Pseudomonas aeruginosa.
2.4. Mơ hình chiết xuất dịch chiết thực nghiệm tại phịng thí nghiệm.
Hình 2.5 Mơ hình chiết xuất dịch chiết lá ngải cứu tại phịng thí nghiệm 2.5. Các phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lý. 2.5. Các phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lý.
2.5.1 Xác định độẩm: Phương pháp phân tích trọng lượng
+ Độ ẩm của mỗi mẫu: 𝑾% = (𝒎𝟏+ 𝒎𝟐) − 𝒎𝟑 𝒎𝟐 × 𝟏𝟎𝟎 + Độ ẩm trung bình: 𝑾𝒕𝒃(%) = ∑ 𝑾(%)𝒏𝟏 𝒏 Trong đó: m1: khối lượng cốc sứ (g) m2: khối lượng mẫu ban đầu (g)
m3: khối lượng cốc sứ và mẫu sau khi sấy (g) n: số lần xác định W%
2.5.2. Xác định hàm lượng tro: Phương pháp phân tích trọng lượng
- Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc tro hố hồn tồn mẫu bằng cách nung mẫu trong lò nung ở nhiệt độ 550C đến khi thu được tro trắng hoàn toàn.
- Các mẫu bột lá ngải cứu (khối lượng m3) đã xác định độ ẩm ở trên tiếp tục được sử dụng để tro hóa. Các mẫu trên được cho vào lò nung và tiến hành tro hoá mẫu ở nhiệt độ
550C trong thời gian 6 tiếng (thu được tro trắng).
- Cứ mỗi 2 tiếng lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phịng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu
đến khối lượng khơng đổi (± 0,1), có khối lượng m4. + Xác định hàm lượng tro:
% 𝒕𝒓𝒐 = 𝒎𝟒𝒎− 𝒎𝟏
𝟐 × 𝟏𝟎𝟎
+ Xác định hàm lượng tro trung bình:
% 𝒕𝒓𝒐 𝒕𝒓𝒖𝒏𝒈 𝒃ì𝒏𝒉 = ∑ % 𝒕𝒓𝒐𝒏
𝟏
𝒏
Trong đó:
m1: khối lượng cốc sứ (g) m2: khối lượng mẫu ban đầu (g)
m4: khối lượng cốc sứ và mẫu sau khi tro hóa (g) n: số lần xác định % tro
2.6. Khảo sát điều kiện chiết
2.6.1. Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi [3;4]
Mục đích: Tỷ lệ ngun liệu/dung mơi là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến khối lượng cao thu được, vì vậy ta cần xác định được đối với 10g
mẫu đã xác định thì cần bao nhiêu ml cồn 96 để thu được khối lượng cao tốt nhất mà vẫn tiết kiệm được dung môi.
Thực nghiệm:
- Chuẩn bị 4 mẫu, mỗi mẫu 10g lá ngải cứu (đã được xử lí). Tiến hành mang mẫu đi chiết soxhlet ở nhiệt độ 76C trong 7 giờ với các thể tích cồn tuyệt đối khác nhau: 250ml, 300ml, 350ml, 400ml.
- Dịch sau khi chiết sẽ được đem đi cơ quay sau đó cân khối lượng cao thu được. Dựa vào khối lượng cao thu được với mỗi thể tích dung mơi khác nhau, cùng thời gian chiết ta sẽ xác định được tỷ lệ nguyên liệu/dung môi nào là phù hợp nhất.
- Khối lượng cao được tính bằng cách cân bình cầu rỗng trước khi cô quay (m1) và khối
lượng bình cầu sau khi cơ quay (m2). Sau đó ta lấy m2 – m1 sẽ ra khối lượng cao thu được.
250ml 300ml 350ml 400ml
Sơ đồ 2. 2 Thực nghiệm khảo sát tỷ lệ dung môi/nguyên liệu
Mẫu lá ngải cứu Cho vào túi lọc đã
may sẵn
Đem chiết với các thể
tích dung mơi khác nhau, thời gian 7 giờ
4 mẫu, mỗi mẫu 10g
Cô quay dịch chiết vừa thu được
Ghi nhận kết quả và
đánh giá thể tích
dung mơi phù hợp Cân khối lượng
bình cầu trước và sau khi cô quay
2.6.2. Khảo sát thời gian chiết
Mục đích: Thời gian chiết cũng là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến khối lượng cao thu được, vì vậy ta cần xác định được đối với 10g mẫu đã xác
định thì cần chiết trong bao nhiêu thời gian để thu được khối lượng cao nhiều nhất. Thực nghiệm:
- Chuẩn bị 4 mẫu, mỗi mẫu khoảng 10g lá ngải cứu (đã được xử lí). Tiến hành mang mẫu đi chiết soxhlet với 250ml cồn tuyệt đối, nhiệt độ 76C ở thời gian khác nhau: 4 giờ, 5 giờ, 6 giờ, 7 giờ.
- Dịch sau khi chiết sẽ được đem đi cơ quay sau đó cân khối lượng cao thu được. Dựa vào khối lượng cao thu được với mỗi thời gian chiết khác nhau, cùng thể tích dung mơi ta sẽ xác định được thời gian nào là tối ưu nhất.
- Khối lượng cao được tính bằng cách cân bình cầu rỗng trước khi cô quay (m1) và khối
lượng bình cầu sau khi cơ quay (m2). Sau đó ta lấy m2 – m1 sẽ ra khối lượng cao thu được.
4h 5h 6h 7h
Sơ đồ 2. 3 Thực nghiệm khảo sát thời gian chiết
Mẫu lá ngải cứu Cho vào túi lọc đã
may sẵn
Đem chiết với thời
gian khác nhau
4 mẫu, mỗi mẫu 10g
Cô quay dịch chiết vừa thu được
Ghi nhận kết quả
và đánh giá tời gian
tối ưu. Cân khối lượng
bình cầu trước và sau khi cô quay
2.7. Khảo sát các yếu tốảnh hưởng đến dịch chiết từ lá ngải cứu
Mục đích: Khảo sát được mẫu có thể bảo quản trong điều kiện nào là tốt nhất.
Thực nghiệm: Lấy các mẫu dịch chiết bằng dung môi cồn tuyệt đối bảo quản trong các
điều kiện khác nhau: vừa mới chiết, để ở nhiệt độ phòng, để trong tủ lạnh.
2.8. Xác định thành phần hóa học có trong dịch chiết lá ngải cứu bằng phương pháp GC/MS GC/MS
Dịch chiết lá ngải cứu được tiến hành cô quay nhằm thu hồi dung môi cho tới khi được chất
đặc (cao thơ). Sau đó gửi mẫu đến: CHI CỤC KIỂM ĐỊNH HẢI QUAN 4, số 10, đường
Ngô Quyền, phường Thọ Quang, quận Sơn Trà, thành phố Đà Nẵng.
2.9. Thăm dị hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đo đường kính vịng kháng khuẩn [13], [24] khuẩn [13], [24]
Chuẩn bị:
- Đĩa petri được rửa sạch sau đó được bọc giấy và đem sấy ở 120C trong 2 tiếng.
- Cắt giấy lọc có đường kính 6mm (15 đĩa), hấp ở 121ºC trong 15 phút, sấy ở 150oC trong 10 phút.
- Pha môi trường thạch MHA – aga - nước cất theo tỷ lệ 38g - 14g - 1000ml. Sau đó đun
sơi đến hơi đặc.
- Đem mơi trường vừa pha đi đo và điều chỉnh độ PH 7.3 và mang đi hấp.
+ Dùng HCl 10% hoặc NaOH 10% để điều chỉnh pH.
+ Muốn kiểm tra độ pH, ta sử dụng máy đo pH vì nó nhạy và cho độ chính xác cao. Nếu khơng có máy, ta có thể sử dụng giấy quỳ để đo pH nhưng khơng có độ chính xác
cao.
Chuẩn bị chủng vi sinh vật thử nghiệm:
Vi khuẩn sau khi lấy về sẽ được cấy ria trên môi trường thạch dinh dưỡng MHA,
đem ủ ở 37 oC trong vòng 16 đến 24 giờ để chọn ra các khuẩn lạc đặc trưng. Khi chọn được khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa thạch khơng bị nhiễm thì đem tăng sinh chúng trong môi trường lỏng TSB rồi ủ ở 37 oC, lắc với tốc độ 100 rpm trong 10 – 12 giờ. Mơi trường trở nên đục do có sự tăng sinh của vi sinh vật.
Tiến hành thí nghiệm:
- Dùng micropipet hút 100µl vi khuẩn mỗi loại (mật độ tế bào 108 CFU/ml), sau đó tiến hành cấy chang trên bề mặt đĩa thạch MHA, chờ khô bề mặt. Đánh số cho đĩa petri từ 1
đến 7. Đĩa giấy 6 mm đã được vô trùng được thấm vào dịch Aloin hoặc Cao đã được pha
theo từng nồng độ lần lượt là 1600, 800, 400, 200 mg/ml và lấy ra đặt lên mặt đĩa thạch đã cấy chang vi khuẩn (số 1: 1600 mg/ml; số 2: 800 mg/ml; số 3: 400 mg/ml; số 4: 200 mg/ml),
đè nhẹ để đĩa giấy cố định trên mặt thạch. Hai đối chứng dương là kháng sinh Tetrcyline và Chloramphenicol được thấm vào đĩa giấy và đặt lên đĩa thạch (số 5: Tetracyline; số 6: Chloramphenicol). Đĩa giấy ở giữa thấm dung dịch đối chứng âm DMSO 5% (số 7).
- Sau đó đem ni ở 37 oC trong 16 – 18 giờ, riêng Staphylococcus aureus nuôi trong 24 giờ. Đọc kết quả và ghi nhận đường kính vịng vơ khuẩn.
Đọc kết quả và ghi nhận đường kính vịng vơ khuẩn: Đường kính vịng vơ khuẩn (D
– d) được xác định bằng đường kính vịng kháng ngồi trừ đi đường kính đĩa giấy.
Hình 2. 6Hình ảnh minh họa vềxác định đường kính vịng vơ khuẩn
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quảxác định một số chỉ tiêu hóa lý của lá ngải cứu 3.1. Kết quảxác định một số chỉ tiêu hóa lý của lá ngải cứu
3.1.1. Độ ẩm
- Lá ngải cứu được tiến hành xác định độ ẩm. Số lượng mẫu được xác định là 3, độ ẩm
chung là độẩm trung bình của 3 mẫu.
- Kết quả xác định độ ẩm trung bình của mỗi mẫu được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3. 1 Bảng xác định độẩm trung bình lá ngải cứu Stt m1 (g) m2 (g) m3 (g) (%) Stt m1 (g) m2 (g) m3 (g) (%) 1 28,218 2,002 30,128 4,59 2 26,232 2,000 28,122 5,50 3 26,858 2,000 28,765 4.65 Độẩm trung bình 4,91
Từ bảng 3.1 cho thấy độ ẩm trung bình của lá ngải cứu là 4,91 %
Hình 3. 1 Hình ảnh mẫu sau khi được xác định độẩm 3.1.2. Hàm lượng tro 3.1.2. Hàm lượng tro
- Lấy 4 mẫu lá ngải cứu đã được xác định độ ẩm ở trên mang đi tro hóa ở nhiệt độ 550C.
Hàm lượng tro trung bình là hàm lượng tro chung của cả 3 mẫu trên.
Bảng 3. 2 Hàm lượng tro trung bình lá ngải cứu
Stt m1 (g) m2 (g) m4 (g) tro (%)
1 28,218 2,002 28,511 14,64
2 26,232 2,000 26,425 9,65
3 26,858 2,000 27,045 9,35
Hàm lượng tro trung bình 11,21
Từ bảng 3.2 cho thấy hàm lượng tro trung bình của lá ngải cứu là 11,21 %
Hình 3. 2 Hình ảnh mẫu sau khi được tro hóa 3.2. Kết quả khảo sát điều kiện chiết lá ngải cứu 3.2. Kết quả khảo sát điều kiện chiết lá ngải cứu
3.2.1. Tỉ lệ dung môi
Bảng 3. 3 Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi Stt Khối lượng Stt Khối lượng
mẫu
Thể tích dung mơi Thời gian chiết
Khối lượng cao thu được
1 10g 250ml 7 giờ 3,181g
2 10g 300ml 7 giờ 2,815g
3 10g 350ml 7 giờ 2,253g
Hình 3. 3 Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi
Qua việc chiết với các tỷ lệ dung môi nhận thấy mẫu sau khi thu hồi đều có độ sánh
mịn và màu như nhau, ở thể tích 250ml lượng cao sau khi cơ quay thu được nhiều hơn.Vì vậy, nên chọn chiết tách trong 250ml để tiết kiệm được kinh phí.
3.2.2. Thời gian chiết Bảng 3. 4 Kết quả khảo sát thời gian chiết Bảng 3. 4 Kết quả khảo sát thời gian chiết Stt Khối lượng mẫu Thể tích dung mơi Thời gian chiết
Khối lượng cao thu được 1 10g 250ml 4 giờ 0,95g 2 10g 250ml 5 giờ 1,57g 3 10g 250ml 6 giờ 2,21g 4 10g 250ml 7 giờ 3,19g Hình 3. 4 Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát thời gian chiết 0 1 2 3 4 250 300 350 400 0 1 2 3 4 4 5 6 7 ml g g ml
Vậy thời gian chiết tốt nhất ở điều kiện khảo sát này là 7 giờ. Vì ở thời gian này khối lượng cao thu được là nhiều nhất.
Kết luận: Với khối lượng mẫu là 10g ta sẽ chọn thể tích dung mơi là 250ml và thời
gian chiết là 7 giờ.
Hình 3. 5 Cao chiết lá ngải cứu
3.3. Kết quả khảo sát các yếu tốảnh hưởng đến dịch chiết lá ngải cứu Bảng 3. 5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên mẫu Bảng 3. 5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên mẫu Mẫu Điều kiện bảo
quản
Hiện tượng 1 Mới chiết xong Mẫu bình thường
2 Để ở nhiệt độ
phịng
Mẫu hư sau 120 giờ (có mùi lạ)
3 Để trong tủ lạnh Mẫu được bảo quản tốt nhất, không bị hư hao.
Như vậy ta sẽ chọn bảo quản mẫu cao sau chiết ở trong tủ lạnh ngăn mát 5C để mẫu được bảo quản tốt nhất.
3.4. Kết quảđịnh danh các thành phần hóa học có trong dịch chiết cao ngải cứu bằng phương pháp GC/MS