CHƢƠNG 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3. Phƣơng pháp thí nghiệm
3.3.2. Các bƣớc tiến hành mơ hình thí nghiệm
3.3.2.1. Phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn
Nuôi cấy làm đồng đều giống: Dùng que cấy chuyển khuẩn lạc đã làm ròng từ ống nghiệm thạch nghiêng đang được lưu trữ trong tủ lạnh, cấy ria sang ống nghiệm mới. Để ống nghiệm trong tủ ấm, nuôi ủ ở 30o
C trong 2 ngày.
Nhân giống cấp 1: Hút 1ml nước cất vô trùng cho vào ống nghiệm chứa vi khuẩn, lắc đều. Hút 100 l dịch huyền phù vi khuẩn cho vào bình tam giác 250 ml
chứa 100 ml môi trường nuôi cấy, tạo giống cấp 1.
Nhân giống cấp 2: Xác định mật số trong giống cấp 1 theo thời gian. Ở thời
điểm mật số vi khuẩn trong giống cấp 1 ở giai đoạn quân bình, tiến hành cấy chuyền tiếp sang môi trường mới, tạo giống cấp 2.
Các bình ni cấy vi khuẩn được đặt trên máy lắc, lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ 30oC.
3.3.2.2. Chuẩn bị mơ hình ngun cứu
Nước rỉ rác Giá bám dạng sợi
Van xả cặn: 1 cái/thùng
Máy sục khí: 2 máy thuộc hãng Resun, Model (ACO-008), output 110lít/min. Số lượng thùng: 9 cái
30
Thể tích thùng: 100 lít/bể
Thể tích xử lý: 80 lít/thùng
Vật liệu bể: nhựa, dày 5 mm
Vi khuẩn: được nuôi tăng sinh khối trước 2 ngày Glucose
3.3.2.3. Xây dựng mơ hình
Đối với thí nghiệm sinh học, mơ hình bể bùn hoạt tính ở phịng thí nghiệm được sử dụng. Đây là mơ hình ni cấy theo mẻ và được khuấy trộn hồn tồn. Với mơ hình này, chúng ta có thể dự đốn q trình hoạt động của vi sinh vật và đánh giá khả năng xử lý của bể bùn hoạt tính đối với loại nước thải cần xử lý.
Xây dựng 2 mơ hình: + Mơ hình bùn hoạt tính
+ Mơ hình bùn hoạt tính kết hợp giá bám vi sinh
Mơ hình bùn hoạt tính Mơ hình bùn hoạt tính & giá bám vi sinh Đối chứng
31
Hình 7: Mơ hình bố trí thí nghiệm (ngày 1/10/2012)
Hình 8: Bố trí giá bám dạng sợi vào thùng ở mơ hình bùn hoạt tính kết hợp giá bám vi sinh (ngày 1/10/2012)
3.3.2.4. Vận hành mơ hình
Bƣớc 1: Nước rỉ rác được lấy tại cống xả của bãi rác Tân Long, huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang. Sau đó được vận chuyển về phòng thí nghiệm Phịng vi sinh vật đất, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Tiến hành xác định các thông số ban đầu: pH, NH4+
, PO43-, COD, TKN, TP, TSS, NO2-, NO3-.
Bƣớc 2: Liều lƣợng
Cả 2 mơ hình bùn hoạt tính và mơ hình bùn hoạt tính kết hợp giá bám vi sinh đều được tiến hành tương tự nhau:
Nước rỉ rác = 80 lít
Vi khuẩn (50 ml vi khuẩn cho 1 lít nước rỉ rác) = 4 lít
Glucose = 400 g
Bƣớc 3: Cách vận hành hệ thống
Cho nước rỉ rác, vi khuẩn, glucose với liều lượng thích hợp vào các thùng chứa. Sau đó sục khí liên tục bằng máy sục khí. Trong q trình sục khí, cần theo dõi chỉ số nồng độ oxy hòa tan trong nước thải (DO – Dissolved Oxygen) để kịp thời điều chỉnh
32 lượng khí cần cung cấp vào thùng. Sau khoảng thời gian 24h, ngừng cung cấp khí để lắng 30 phút, tiến hành lấy mẫu nước để phân tích.
Bƣớc 4: Thời gian thí nghiệm
Sau khi mơ hình đạt kết quả ổn định, tiến hành lấy mẫu nước đem phân tích các chỉ tiêu và đồng thời rút 25% và bổ sung 25% nước rỉ rác mới. Sau thời gian tiếp tục ổn định tiến hành rút 50% và bổ sung 50% nước rỉ rác mới và lượng nước thải lấy ra này thay đổi dựa vào kết quả xử lý. Thí nghiệm kéo dài khoảng 15 ngày (đến khi kết quả ổn định).
Bƣớc 5: Các chỉ tiêu theo dõi
Đo mẫu hàng ngày: pH, NH4+
, PO43- .
COD, TKN, TP, TSS, NO2-
, NO3-: ngày đầu, ngày thứ 4, ngày thứ 8, ngày thứ 12.
3.3.2.5. Cách lấy mẫu
Ngừng hệ thống sục khí
Chờ cho nước ổn định sau 30 phút
Mẫu đo pH, đạm, lân thì sử dụng chai 500 ml lấy mẫu bằng van xả
Mẫu đo COD, TSS, TKN, TP, NO2-, NO3-: thì sử dụng chai 2 lít lấy mẫu bằng van xả.
3.3.3. Phƣơng pháp phân tích mẫu 3.3.3.1. pH 3.3.3.1. pH
Rửa điện cực bằng nước cất, lau khô điện cực, dùng dung dịch chuẩn để chỉnh máy.
Rửa lại điện cực bằng nước cất, lau khô, đổ khoảng 50 ml mẫu ra cốc thủy tinh. Nhúng đầu điện cực vào nước thải, tiến hành đọc kết quả trên máy khi tín hiệu ổn định sau 30 giây.
3.3.3.2. Đạm N_NH4+
33 Tiến hành theo dõi hàm lượng ammonium trong tất cả các nghiệm thức mỗi ngày bằng máy đo đạm N_NH4+. Quy trình thực hiện đo đạm N_NH4+: Dựa vào phương pháp Indophenol Blue (Keeney Nelson, 1982) bằng cách đo hàm lượng N_NH4+
trong môi trường để đánh giá khả năng khử đạm của các chủng vi khuẩn theo nguyên tắc: NH4+ + Phenol Hypochloride ion (môi trƣờng kiề m) Indophenol (có màu xanh)
Cách đo: Sử dụng đạm chuẩn (1ppm) Bảng 5: Đƣờng chuẩn đo đạm N_NH4+ Đƣờng chuẩn 0 1 2 3 4 5 H2O 2,5 ml 2 ml 1,5 ml 1 ml 0,5 ml 0 ml Đạm chuẩn 0 ml 0,5 ml 1 ml 1,5 ml 2 ml 2,5 ml EDTA 0,5 ml Nitroprusside 1 ml Hypocloride 2 ml Tiến hành:
Dựng dãy đường chuẩn (gồm 6 ống nghiệm 20 ml): hút lần lượt 2,5; 2; 1,5; 1; 0,5; 0 ml nước cất cho vào 6 ống nghiệm được đánh số từ 0 đến 5. Cho lần lượt 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2, 5 ml dung dịch đạm chuẩn có hàm lượng 1 mg/l N-NH4+. Thêm lần lượt stock 1 là 0,5 ml, stock 2 là 1ml, stock 3 là 2 ml vào mỗi ống, trộn đều dung dịch trên máy Vortex. Ống đầu tiên là mẫu blank. Khi đó ta được đường chuẩn với hàm lượng các ống theo thứ tự tăng dần là 0-1-2-3-4-5 mg/l N_NH4+
.
Mẫu nước thải: Hút lần lượt 2 ml dung dịch mẫu nước thải đem đi ly tâm 10.000 (vịng/phút) trong vịng 5 phút. Sau đó rút 0,5 ml mẫu đã ly tâm cộng thêm 2 ml nước cất cho vào ống nghiệm. Thêm lần lượt stock 1 là 0,5 ml, stock 2 là 1 ml, stock 3 là 2 ml vào mỗi ống, trộn đều trên máy Vortex.
Để ổn định 15 – 20 phút ở nhiệt độ phòng. Tiến hành đo đạm trong mẫu. Đo đạm ở bước sóng 636 nm.
Dựa vào phương trình đường chuẩn: A = a*C + b
34 A là độ hấp thụ quang.
Dựa vào độ hấp thụ quang của mẫu cần phân tích để tính hàm lượng N_NH4+ có trong mẫu nước thải theo cơng thức: C = (A – b)/a.
Sử dụng phần mềm Excel 2007 để thiết lập phương trình đường chuẩn N_NH4+ tinh khiết.
3.3.3.3. Lân P2O5
Phương pháp này áp dụng theo: SMEWW 4500-P-2005
Cách đo: Sử dụng lân chuẩn (10 ppm) Bảng 6: Đƣờng chuẩn đo lân P2O5
Đƣờng chuẩn 0 1 2 3 4 5
H2O 8 ml
Lân chuẩn 0 ml 0,5 ml 1 ml 1,5 ml 2 ml 2,5 ml
Dung dịch B 4 ml
Tiến hành:
Dựng dãy đường chuẩn (gồm 6 ống nghiệm 20 ml): hút lần 8 ml nước cất cho vào 6 ống nghiệm được đánh số từ 0 đến 5. Cho lần lượt 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2, 5 ml dung dịch lân chuẩn có hàm lượng 10 mg/l P2O5. Thêm 4 ml dung dịch B vào mỗi ống, trộn đều dung dịch trên máy Vortex. Ống đầu tiên là mẫu blank. Khi đó ta được đường chuẩn với hàm lượng các ống theo thứ tự tăng dần là 0-1-2-3-4-5 mg/l P2O5.
Mẫu nước thải: Hút lần lượt 2 ml dung dịch mẫu nước thải đem đi ly tâm 10.000 (vịng/phút) trong vịng 5 phút. Sau đó rút 0,5 ml mẫu đã ly tâm cộng thêm 6 ml nước cất cho vào ống nghiệm. Thêm 4 ml dung dịch B vào mỗi ống, trộn đều trên máy Vortex.
Để ổn định 15 – 20 phút ở nhiệt độ phòng. Tiến hành đo Lân trong mẫu. Đo Lân ở bước sóng 880 nm.
35 Trong đó: C là hàm lượng lân của mẫu (mg/l)
A là độ hấp thụ quang.
Dựa vào độ hấp thụ quang của mẫu cần phân tích để tính hàm lượng P2O5 có trong mẫu nước thải theo công thức: C = (A – b)/a.
Sử dụng phần mềm Excel 2007 để thiết lập phương trình đường chuẩn P2O5 tinh khiết.
Chuyển đổi P2O5 thành PO43-: Hàm lượng PO43- = Hàm lượng P2O5*0,747
3.3.3.4. Xác định mật số tế bào vi khuẩn đạm và vi khuẩn tích lũy polyphosphate trong bùn hoạt tính
Xác định mật số vi khuẩn bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt.
Hình 9: Phƣơng pháp đếm sống nhỏ giọt mật số vi khuẩn
Pha loãng 101 dung dịch chứa bùn hoạt tính: chuyển 1 ml mẫu đựng trong eppendoft tiến hành vortex rồi cho vào ống nghiệm có sẵn 9 ml nước cất đã khử trùng.
Lắc đều các ống pha loãng, dùng pipet hút 10 µl mẫu ở ống nghiệm có độ pha lỗng muốn tiến hành xác định mật số nhỏ giọt vào môi trường đặc trong đĩa petri. Mỗi đĩa petri chia làm 3 phần đều nhau và nhỏ ở 3 độ pha loãng liên tiếp nhau.
Để các giọt mẫu khô dưới ngọn lửa đèn cồn trong tủ cấy. Đậy nắp và lật ngược đĩa lại.
Mang đĩa vào cất trong tủ ủ. Quan sát kết quả sau 24 giờ hoặc 48 giờ ủ ở 300C.
Đếm số khuẩn lạc trung bình ở mỗi độ pha lỗng. 1 ml
1/103 1/104 1/105
…1/10n
36
Số vi khuẩn trong 1 ml mẫu = số khuẩn lạc trung bình* độ pha lỗng * 102
3.3.3.5. Xác định trọng lƣợng của bùn lắng
Trọng lượng bùn lắng được xác định bằng cách: Sấy khô giấy lọc, đem cân trọng lượng. Cho cặn lắng của nước thải sau khi xử lý đi qua giấy lọc đã được sấy khô, lấy phần cặn với giấy lọc sấy khô lần hai. Sấy đến khi trọng lượng khơng đổi thì đem đi cân. Lấy trọng lượng cân được ở lần hai trừ đi trọng lượng cân ở lần thứ nhất sẽ được trọng lượng của bùn lắng.
3.3.3.6. Phƣơng pháp phân tích COD (Phương pháp đun kín)
Phương pháp này áp dụng theo: SMEWW 5220-C- 2005
a. Hóa chất
Dung dịch chuẩn K2CrO7 0,0167M: hòa tan 4,913 g K2CrO7 (sấy 1050C trong 2 giờ) trong 500 ml nước cất, thêm 167 ml H2SO4, khuấy tan để nguội đến nhiệt độ phòng, định mức thành 1000 ml.
Acid sulfuric reagent: Cân 5,5 g Ag2SO4 trong 1 kg H2SO4 đậm đặc (1 lít = 1,84 kg), để 1 – 2 ngày cho hịa tan hồn tồn Ag2SO4
Dung dịch ferrous ammonium sulfate (FAS) 0,1M: hòa tan 9,8 g
Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O trong một ít nước cất, thêm vào 20 ml H2SO4 đậm đặc, làm lạnh và định mức thành 1000 ml.
Chỉ thị màu feroin: hòa tan 1,485 g 1-10 phenantroline monohydrate và 0,695 g FeSO4.7H2O trong nước cất và định mức thành 100 ml.
Bảng 7: Tỉ lệ thể tích mẫu và hóa chất dùng trong phân tích COD
Thể tích mẫu Dd KCr2O7 H2SO4 reagent Tổng thể tích
2,5 ml 1,5 ml 3,5 ml 7,5 ml
b. Thực hiện
Pha loãng mẫu: pha loãng 100 lần (1 ml mẫu + 99 ml nước cất)
Rửa sạch ống nghiệm có nút vặn kín với H2SO4 20% trước khi dùng. Cho thể tích mẫu và thể tích hóa chất dùng như bảng 7.
37
Cho mẫu vào ống nghiệm, thêm dung dịch K2CrO7 vào, cẩn thận cho từ từ H2SO4 reagent theo thành ống nghiệm. Đậy kín nút, lắc nhẹ và đặt lên máy COD ở 1500C/ 2 giờ. Để nguội đến nhiệt độ phòng, đổ vào erlen, tráng ống COD bằng nước cất và đổ vào erlen, sau đó nhỏ thêm vài giọt feroin và định phân bằng FAS 0,1N. Dứt điểm khi mẫu chuyển từ xanh lục sang nâu đỏ. Làm một mẫu thử không với nước cất (cũng bao gồm các hóa chất như mẫu thật nhưng thay mẫu bằng nước cất, ủ 1500
C/ 2 giờ). COD (mgO2/l) = xf ml V xMx B A ) ( 8000 ) ( Trong đó:
+ A: thể tích FAS dùng trong ống thử không, ml + B: thể tích FAS dùng trong ống thử thật, ml + f: hệ số pha loãng
+ M: nguyên chuẩn độ của FAS + V: thể tích mẫu đã dùng, ml
3.3.3.7. Phƣơng pháp xác định phospho tổng trong nƣớc thải
Phương pháp này áp dụng theo: SMEWW 4500-P-2005
Nguyên tắc :
Mẫu được vơ cơ hóa để chuyển các dạng photpho về orthophoyphat. Ammonium molybdate và kali antimon photphomolybdat sẽ phản ứng với orthophotphat để hình thành phức antimon photphomolybdat. Khử phức này bằng acid ascorbic tạo thành phức molybden màu xanh. Đo màu tại bước sóng 880nm.
Tiến hành :
Vơ cơ hóa mẫu : Dùng hỗn hợp acid sulfuric và acid nitric
Lấy chính xác 50 ml mẫu cho vào bình Kjeldahl. Thêm từ 1ml acid sulfuric (H2SO4) đậm đặc và 5 ml acid nitric (HNO3) đậm đặc. Đun trên bếp đặc trong tủ hút tới khi xuất hiện khói trắng và đun tiếp cho tới khi dung dịch trong và không màu.
38 Làm nguội và thêm từ từ 20 ml nước cất, thêm 1 giọt chỉ thị phenolphtalein, thêm từ từ NaOH 2N cho đến khi dung dịch có màu hồng nhạt. Chuyển mẫu và bình định mức 50 ml, định mức đến vạch ( lọc nếu dung dịch bị đục hoặc có cặn).
Phân tích mẫu
Lấy 10 ml mẫu, thêm 5 ml thuốc thử vào mẫu đã chuẩn bị, đo màu ở bước sóng 880 nm sau 10 phút. Tính kết quả từ đường chuẩn.
3.3.3.8. Phƣơng pháp xác định Nitơ tổng số trong nƣớc thải
Phương pháp này áp dụng theo: TCVN 5987-1995
Nguyên tắc
Chuyển các hợp chất nitơ trong mẫu thử thành amoni sunfat bằng cách vơ cơ hóa với axti sunfuric có chứa lượng lớn kali sunfat để tăng điểm sơi của hỗn hợp và có CuSO4 làm xúc tác.
Giải phóng amoni sunfat bằng cách thêm kiềm và chưng cất vào dung dịch axit boric/ chỉ thị
Tiến hành:
Lấy 100 ml mẫu nước thải cho vào Becher, đun trên bếp điện tới khi còn 20 ml, để nguội
Cho vào đó 0,15 mg K2SO4 và 0,05 mg CuSO4 hòa tan, sau đó cho vào 5 ml sulfuric acid đặc. Cho tất cả vào bình phá mẫu, đun phá mẫu đến khi nào mẫu chuyển sang trong đặc trưng.
Sau khi phá mẩu, cho tất cả hỗn hợp mẫu vào bình định mức, định mức tới 100ml bằng nước cất.
Bình cất đạm: cho vào 50 ml mẫu + 50 ml nước cất + 3 giọt tashiro dung dịch chuyển sang màu tím + 15 ml dd NaOH 40% dung dịch chuyển sang màu xanh lá mạ.
Bình hứng: Cho 20 ml dd sulfuric acid 0,1N + 3 giọt tashiro.
Lắp bình cất đạm và bình hứng vào Bộ chưng cất Kjedalh, cất trong khoảng 30 phút. Đem bình hứng đi chuẩn độ bằng dd NaOH 0,1N .
39
Chú ý: với phương pháp công phá Kjeldahl, kết quả hàm lượng đạm thu được gọi
là tổng đạm Kjeldahl (Total Kjeldahl Nitrogen - TKN). TKN bao gồm hàm lượng đạm hữu cơ và TAN có trong mẫu nước (TKN=N-Hữucơ + TAN). Trong trường hợp này nếu muốn tính được tổng đạm (TN) chúng ta phải xác định thêm hàm lượng đạm nitrite và nitrate.
TN = TKN + N-NO2-+ N-NO3
Nếu trước khi công phá mẫu chúng ta loại bỏ TAN bằng cách nâng pH của mẫu nước lên 9,5, khi đó NH4+ sẽ chuyển hoàn toàn thành NH3. Đun nhẹ mẫu, NH3 sẽ thốt ra khơng khí sau đó mới cơng phá mẫu. Trong trường hợp này kết quả hàm lượng đạm thu được chính là đạm hữu cơ (TKN = N-Hữu cơ).
- Lượng Nitơ trong nước thải tính bằng cơng thức: N (mg/l) = ) ( 1000 14 ) ( ml V x xMx B A Trong đó: + A : Thể tích chuẩn mẩu thật (ml) + B: Thể tích chuẩn mẩu trắng (ml) + B: Thể tích mẫu lấy phân tích (ml) + M: Nồng độ NaOH chuẩn (N)
3.3.3.9. Phƣơng pháp phân tích TSS
Áp dụng theo: SMEWW 2540D-2005 Thực hiện
- Giấy lọc chứa mẫu đem sấy ở 1000C/1 giờ, sau đó để vào máy hút ẩm trong 60 phút, đem cân được khối lượng A.
- Pha loãng mẫu 10 lần, hút 10 ml để lọc.
- Đem giấy lọc đi sấy ở 1000C/1 giờ; sau đó để vào máy hút ẩm trong 1 giờ, đem ra cân được khối lượng B.
40 TSS = xf ml V x B A ) ( 1000 ) ( Trong đó: TSS: Tổng hàm lượng cặn lơ lững (mg/l)
A: khối lượng ban đầu của giấy lọc (mg)