CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.4 Hệ xúc tác tế bào E.coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống cytochrome P450
Để thực hiện chức năng xúc tác, đại đa số các enzyme P450 sử dụng nguồn điện tử từ cofactor NAD(P)H thơng qua chu i vận chuyển điện tử, gồm có một hoặc một vài protein vận chuyển điện tử, gọi là các redox partner.
Nhƣ vậy, hầu hết các P450 không thể độc lập thực hiện chức năng xúc tác mà cần phải đi cùng với một chu i vận chuyển điện tử. Đây chính hạn chế lớn nhất cản trở việc ứng dụng P450 trong thực tế. Thứ nhất, NAD(P)H là những chất có giá thành cao; thứ hai, việc chuyển hóa cơ chất cần đồng thời cả P450 và các redox partner của nó vì vậy việc ứng dụng ở qui mô lớn là không khả thi. Mặc dù các nhà nghiên cứu đã cố gắng tìm kiếm giải pháp thay thế NAD(P)H bằng nguồn điện tử khác, nhƣ sử dụng peroxide H2O2. Tuy nhiên, phƣơng pháp đó ít có ý nghĩa ứng dụng thực tế do enzyme không bền và hiệu quả truyền điện tử k m [46], [39]. Cũng
chính vì sự phụ thuộc vào cofactor này của P450s mà cho đến nay ứng dụng của P450 trong công nghiệp thƣờng đƣợc thực hiện thơng qua hệ thống chuyển hóa tế bào, thƣờng là các chủng vi sinh vật tự nhiên. Chẳng hạn, việc chuyển hóa compactin thành pravastatin bởi CYP105A3 đƣợc thực hiện thơng qua q trình lên men chủng Streptomyces carbophilus hay sản xuất cortisol từ 11-deoxycortisol bởi P450lun nhờ lên men chủng Curvularia lunata [39].
Để mở rộng hơn khả năng ứng dụng của P450, sử dụng hệ xúc tác tế bào vi sinh vật tái tổ hợp biểu hiện đồng thời gene mã hóa cho P450 và các redox partner của nó, là một giải pháp thƣờng đƣợc lựa chọn hiện nay [46]. Giải pháp này có lợi thế là có thể tận dụng nguồn cofactor nội sinh của tế bào chủ, các enzyme thực hiện chức năng chuyển hóa cơ chất trong mơi trƣờng tự nhiên nên bền vững và khơng địi hỏi q trình tinh sạch tốn k m. Trong số các vi sinh vật hay đƣợc sử dụng trong công nghiệp, E. coli là vật chủ đƣợc sử dụng nhiều nhất do chúng có thời gian sinh trƣởng ngắn, năng suất biểu hiện cao, chi phí cho sản xuất thấp và dễ dàng thao tác điều khiển.
Để đồng biểu hiện, gene mã hóa P450 và các redox partner có thể đƣa m i gene này vào một vector riêng rồi biến nạp vào E. coli. Các vector này cần chứa
gene kháng kháng sinh khác nhau và vùng khởi đầu sao ch p tƣơng thích với nhau để có thể cùng tồn tại trong tế bào chủ. Hannermann và công sự đã thiết kế hệ thống chuyển hóa steroid nhờ E. coli. Trong nghiên cứu này, vector pACYC FHH2 mang gene mã hóa CYP106A2 từ Bacillus megaterium ATCC 13368 đƣợc đồng biến nạp với vector pBAR Twin chứa gene mã hóa cho AdR và Adx vào E. coli JM109, sau đó đồng biểu hiện để chuyển hóa 11 -deoxycorticosterone thành 15β-hydroxy-11- deoxycorticosterone [13].
Gần đây, thay vì đƣa vào các vector độc lập, ngƣời ta chỉ sử dụng một vector trong đó gene mã hóa P450 và các redox protein đƣợc sắp xếp dƣới dạng cấu trúc multicistronic. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là đảm bảo tất cả các gene đƣợc đồng biểu hiện trong cùng một tế bào, giảm chi phí nghiên cứu và tạo đƣợc dịng tế bào bền vững. Girhard và cộng sự đã thành công trong việc xây dựng hệ xúc tác tế bào
partner của nó để chuyển hóa valencene thành nootkatone. Chuyển hóa camphor thành dẫn xuất 5-exo-hydroxycamphor cũng đƣợc thực hiện nhờ tế bào E. coli tái tổ hợp chứa cấu trúc tricistronic của P450cam - putidaredoxin (Pd)-putidaredoxin reductase (PdR). Trong một nghiên cứu khác, E.coli tái tổ hợp chứa cấu trúc
tristronic của CYP27A1- Adrenodoxin reductase - Adrenodoxin cũng đƣợc xây dựng để chuyển hóa cholesterol và vitamin D3. Nghiên cứu gần đây của Ringle và cộng sự cũng xây dựng hệ xúc tác E. coli tái tổ hợp với multicistronic vector chứa gene mã hóa CYP264A1 từ myxobacterium Sorangium cellulosum So ce56 với
redox partner là Adrenodoxin và E. coli reductase. Hệ thống này đƣợc áp dụng
thành cơng để chuyển hóa 4-methyl-3-phenyl-coumarin thành 4-hydroxymethyl-3- phenyl-coumarin [37].
M t s ư i m và hạn ch của h xúc tác t bào:
Ưu điểm:
- Có thể thực hiện phản ứng xúc tác ở điều kiện nhẹ nhàng trong khi các phản ứng chuyển hóa bằng con đƣờng hóa học lại địi hỏi điều kiện khắc nghiệt, chi phí cao và tạo ra nhiều chất thải độc hại làm ảnh hƣởng đến môi trƣờng.
- Enzyme thực hiện chức năng chuyển hóa trong mơi trƣờng tự nhiên nên bền vững và khơng địi hỏi q trình tinh sạch tốn kém (tinh sạch 3 protein).
- Không cần cung cấp các cofactor từ bên ngồi cho phản ứng oxi hóa khử khử mà sử dụng ln nguồn cofactor nội sinh của tế bào chủ.
- So với các phƣơng pháp sử dụng enzyme cố định trên giá thể thì việc sử dụng hệ xúc tác tế bào có ý nghĩa vƣợt trội về độ bền vững và giá thành.
- So với phƣơng pháp hóa học thì hệ xúc tác sinh học dựa trên hệ thống P450 có nhiều khả năng tạo ra những dẫn xuất mới hơn.
Hạn chế:
- Quy trình phức tạp hơn việc sử dụng enzyme xúc tác.
- Xuất hiện các khả năng và sản phẩm khơng mong muốn do có nhiều loại enzyme khác có mặt trong hệ xúc tác [26].