CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Nhân dòng plasmid pETC4AA và kiểm tra sự có mặt của gene mã hóa
CYP264B1, AdR và Adx
Plasmid pETC4AA đƣợc biến nạp vào E. coli TOP10F‟ để nhân dòng. Chủng tái tổ hợp đƣợc trải trên mơi trƣờng LB đặc chứa 100µg/ml ampicillin và ủ ở 37oC trong 16 giờ. Để lựa chọn khuẩn lạc mang plasmid pETC4AA, một số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR colony nhờ cặp mồi đặc hiệu (C4-F và C4-R) để nhân gene mã hóa cho CYP264B1. Kết quả trên hình 3.1 cho thấy khuẩn lạc đƣợc lựa chọn có chứa đoạn gene có kích thƣớc tƣơng tự kích thƣớc của gene mã hóa CYP264B1 (1257 bp).
Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR colony
Giếng 1,2,3: Sản phẩm PCR colony 3 khuẩn lạc Giếng 4: Marker Smart Ladder (Eurogentec)
Các khuẩn lạc sau đó đƣợc ni lắc 200 v/p trong môi trƣờng LB lỏng qua đêm để tách plasmid. Để khẳng định chắc chắn plasmid tái tổ hợp pETC4AA đã đƣợc nhân dịng và các gene khơng có điểm đột biến nào, plasmid đƣợc gửi đi đọc trình tự với 2 cặp mồi: cặp mồi 1 (C4-F và C4-R) để nhân đoạn gene CYP264B1 và cặp mồi 2 (AdR-F và Adx-R) để nhân đoạn gene AdR-Adx có kích thƣớc 1716 bp.
Kết quả đọc trình tự cho thấy các trình tự gene mã hóa cho CYP264B1 (1257 bp), AdR (1386 bp), Adx (330 bp) khơng có điểm đột biến nào (Phụ lục II).
Ngồi ra, trong plasmid pETC4AA, 3 gene mã hóa đƣợc đƣa vào vùng trình tự tạo dịng và đƣợc sắp xếp theo thứ tự CYP264B1- AdR- Adx. Để sự dịch mã cả 3 gene thực hiện đƣợc, trƣớc trình tự khởi đầu của m i gene (đầu 5‟) đều đƣợc thêm vào trình tự vùng liên kết ribosome (ribosome binding sites - rbs). Cấu trúc đa gene trên plasmid pETC4AA đƣợc minh họa trên hình 3.2.
Hình 3.2. Cấu trúc đa gene trên vector pETC4AA
Plasmid này sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli C43(DE3). Dịch biến nạp đƣợc trải trên mơi trƣờng LB đặc chứa 100µg/ml ampcillin và đƣợc ủ ở 37o
C trong 16 giờ để hình thành những khuẩn lạc đơn. Các khuẩn lạc này s đƣợc sử dụng để biểu hiện gene và chuyển hóa cơ chất.
3.2 Kiểm tra khả năng biểu hiện gene
Trong plasmid pETC4AA, 3 gene đƣợc sắp xếp theo thứ tự CYP264B1- AdR- Adx. Vì vậy, trong phần này chúng tôi chỉ kiểm tra khả năng biểu hiện gene của CYP264B1 và Adx.
3.2.1 Khả năng i u hi n gene CYP264B1
Q trình ni cấy tế bào E. coli C43DE3 mang plasmid tái tổ hợp pETC4AA đƣợc mô tả trong phần phƣơng pháp. Sau 24 giờ cảm ứng IPTG, tế bào đƣợc thu nhận bằng ly tâm 6000 v/p trong 15 phút, sau đó đƣợc rửa và hòa trong đệm Lysis buffer. Tiếp theo tế bào đƣợc phá vỡ bằng phƣơng pháp siêu âm và ly tâm 20000 v/p trong 30 phút để thu dịch chiết protein thô. Để đo hàm lƣợng CYP264B1, dịch chiết thô đƣợc bổ sung natri dithionite (1mg/ml) nhằm khử nguyên tử Fe trong nhân heme, sục khí CO với tốc độ 1 bọt khí/giây trong 30 giây để nguyên tử Fe tạo phức với CO, sau đó đo phổ hấp thụ UV-Vis của dịch này.
ở 450 nm. Nồng độ của CYP264B1 trong dịch đƣợc xác định theo công thức của Omura và Sato (1964). Kết quả cho thấy CYP264B1 đƣợc biểu hiện với hàm lƣợng 579 nmol/l mơi trƣờng ni cấy.
Hình 3.3. Phổ hấp thụ ánh sáng trong vùng 400-500 nm của dịch chiết tế bào
C43DE3/pETC4AA sau 24 giờ cảm ứng. Đƣờng kẻ đỏ: Phổ hấp thụ ở lần đo 1
Đƣờng kẻ đen: Phổ hấp thụ ở lần đo 2 sau 30s.
3.2.2 Khả năng i u hi n của Adx
Để kiểm tra khả năng biểu hiện Adx, tế bào sau 24 giờ cảm ứng bằng IPTG đƣợc thu nhận bằng ly tâm, protein trong tế bào đƣợc giải phóng và biến tính bằng phƣơng pháp đun sơi trong đệm mẫu chứa SDS và mecarptoethanol nhƣ mô tả trong phần phƣơng pháp. Protein sau khi đƣợc phân tách trên trên gel polyacrylamide (Hình 3.4) đƣợc chuyển lên màng lai để kiểm tra phản ứng với kháng thể đặc hiệu của Adx bằng phƣơng pháp Western blot (hình 3.5).
Kết quả phân tích trên gel polyacrylamide trên hình 3.4 cho thấy mẫu protein ngoại bào thu đƣợc từ dịch nuôi cấy tế bào E. coli C43DE3 mang plasmid pETC4AA (giếng số1) và từ dịch nuôi cấy tế bào E. coli C43DE3 mang plasmid pET17b (giếng số 2) đều xuất hiện rất nhiều băng tạo thành dải, băng có kích thƣớc phân tử dƣới 15 kDa rất mờ, khó phân biệt đƣợc với bên đối chứng. Để kiểm tra
chính xác sự biểu hiện của gen Adx, chúng tơi kiểm tra khả năng liên kết với kháng thể đặc hiệu kháng Adx bằng kỹ thuật Western blot.
Hình 3.4. Kết quả điện di protein ngoại bào
Giếng 1: Mẫu protein ngoại bào thu đƣợc từ dịch nuôi cấy tế bào E. coli C43DE3 mang plasmid pETC4AA
Giếng 2: Mẫu protein ngoại bào thu từ dịch nuôi cấy tế bào E. coli C43DE3 mang plasmid pET17b (đối chứng âm)
Giếng 3: Thang protein chuẩn
Kết quả phân tích khả năng liên kết với kháng thể đặc hiệu kháng Adx trên hình 3.5 cho thấy: ở giếng số 2 (mẫu xử lý với kháng thể Adx của protein ngoại bào thu đƣợc từ dịch nuôi cấy tế bào C43DE3/pET17b-mẫu đối chứng âm) không xuất hiện băng nào, trong khi ở đƣờng chạy số 3 (mẫu xứ lý với kháng thể của protein ngoại bào thu đƣợc từ dịch nuôi cấy tế bào C43DE3/pETC4AA) xuất hiện 1 băng màu đen đặc trƣng, đúng với kích thƣớc của Adx (12 kDa) bắt cặp đặc hiệu với kháng thể kháng Adx.
Hình 3.5. Phân tích khả năng biểu hiện Adx với kháng thể đặc hiệu bằng kỹ thuật
Western blot
Giếng 1: Thang protein chuẩn của PEQLAB (Erlangen, Germany);
Giếng 2: Mẫu protein ngoại bào thu đƣợc từ dịch nuôi cấy tế bào C43DE3 mang plasmid pET17b (đối chứng âm);
Giếng 3: Mẫu protein ngoại bào thu đƣợc từ dịch nuôi cấy tế bào C43DE3 mang plasmid tái tổ hợp pETC4AA.
3.3 Kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone của hệ xúc tác tế bào C43DE3/CYP264B1 – AdR - Adx