Ở 3 dòng vi khuẩn ái nhiệt, bắt đầu từ ngày 1, enzyme protease đã xuất hiện, hoạt tính tăng dần và đạt giá cao nhất vào từng thời điểm khác nhau. Cụ thể, hoạt tính protease dịng P1 đạt cao nhất vào ngày 5 (10,81 U/ml), dòng P2 bắt đầu từ ngày 6 (7,75 U/ml) và dòng P3 vào ngày 8 (9,81 U/ml).
Tương tự, ở 3 dịng vi khuẩn bình nhiệt, hoạt tính protease của dịng P4 cao nhất vào ngày 8 (8,31 U/ml), dòng P5 vào ngày 7 (6,66 U/ml) và dòng P6 vào ngày 5 (7,22 U/ml). Mặc dù, giá trị hoạt tính dịng P4 đạt cực đại lâu hơn 2 dòng P5 và P6 nhưng khuynh hướng chung giá trị hoạt tính của dịng P4 ở các ngày trước gần xấp xỉ với 2 dòng cịn lại.
Rõ ràng, hoạt tính protease của các dịng vi khuẩn ái nhiệt tương đối cao hơn các dịng vi khuẩn bình nhiệt. Trong đó, hoạt tính dịng ái nhiệt P1 cao
nhất, tiếp theo là dịng bình nhiệt P4. Dó đó, 2 dịng bình nhiệt và ái nhiệt chọn là P1 và P4.
4.3 Khảo sát khả năng thủy phân rác hữu cơ trong bình 10 kg đối với các nhóm vi khuẩn đã đƣợc tuyển chọn
4.3.1 Nhiệt độ mẻ ủ rác
Nhiệt độ mẻ ủ rác trong bình dao động trong khoảng 35 -49oC, điều kiện cho nhóm vi khuẩn bình nhiệt phát triển (Hình 4.6). Trong 15 ngày, nhiệt độ mẻ ủ rác vẫn cịn duy trì ở mức 46-48,5oC, cụ thể giá trị này đạt cao vào ngày 8, ngày11 và ngày 12.
Hình 4.6: Sự chênh lệch nhiệt độ giữa các nghiệm thức với mơi trường ngồi Nhiệt độ ở các nghiệm thức đều đạt cao nhất vào ngày 11 với giá trị dao động khoảng 46,7-48,1oC. Trong đó, nhiệt độ ở ba chế phẩm cao hơn so với nhiệt độ ở đối chứng (Bảng 4.4).
Bảng 4.4: Sự khác biệt nhiệt độ giữa đối chứng với mẻ ủ rác theo ngày Ngày Đối chứng (oC) Chế phẩm 1 (oC) Chế phẩm 2 (oC) Chế phẩm 3 (oC) 8 46,1 46,8 48,7 48,1 11 46,7 47,8 49,1 48,1 12 46,1 47,1 48,7 47,3 4.3.2 pH nƣớc rỉ rác của mẻ ủ
Nhìn chung pH trong mẻ ủ rác có tính acid và có xu hướng tăng cao nhất vào khoảng ngày 5-7 ở mỗi nghiệm thức và giá trị giảm dần ở các ngày còn lại. Trong đó, pH ở mẫu đối chứng và nghiệm thức CP1 tăng cao nhất vào ngày 5, trong khi các nghiệm thức còn lại đạt giá trị cao nhất lần lượt vào ngày 6 (CP3) và ngày 7 (CP2) (Bảng 4.5).
Bảng 4.5: So sánh pH giữa 5 ngày được chọn của mỗi nghiệm thức
Ngày Đối chứng Chế phẩm 1 Chế phẩm 2 Chế phẩm 3
5 6,25 5,70 5,43 5,53
6 6,13 5,47 5,44 5,77
7 5,95 5,40 5,80 5,77
Mặc dù pH của mẫu đối chứng cao hơn so với các nghiệm thức ở những ngày đầu nhưng khơng có khác biệt ý nghĩa.
4.3.3 Mật số ba nhóm vi khuẩn log10(CFU/g)
Nhìn chung, mật số ba nhóm vi khuẩn bình nhiệt chiếm ưu thế gấp khoảng 2-5 lần so với mật số ba nhóm vi khuẩn ái nhiệt có trong mẻ ủ rác hữu cơ ở ba thời điểm khảo sát. Ngoài ra, giá trị mật số giữa nghiệm thức và ngày có tương tác với nhau ở mức ý nghĩa 5% (Bảng 4.6 và Bảng 4.7).
Bảng 4.6: So sánh mật số 3 nhóm vi khuẩn bình nhiệt và ái nhiệt theo thời gian – log (CFU/g)
Ngày CV % Môi trường tinh bột CV % Môi trường cellulose CV % Môi trường protein Nhóm bình nhiệt 5 7,54 6,41a 11,12 5,83a 15,81 6,69a 10 8,24 6,61a 17,76 6,16b 10,35 7,08b 15 13,48 6,65a 8,00 6,47c 7,81 7,50c Nhóm ái nhiệt 5 9,11 1,89a 17,18 1,95a 12,57 1,86a 10 10,33 3,16b 14,10 2,91b 24,52 1,81a 15 7,61 3,95c 8,99 3,17c 10,40 4,06b
Trong ba thời điểm khảo sát, mật số ba nhóm vi khuẩn bình nhiệt và ái nhiệt ở ngày 10 và 15 cao hơn so với mật số ở ngày 5, ngoại trừ mật số nhóm vi khuẩn bình nhiệt thủy phân tinh bột (giá trị log tại ba thời điểm khơng có khác biệt ý nghĩa) và nhóm ái nhiệt thủy phân protein (giá trị log hai thời điểm đầu khơng có khác biệt ý nghĩa). Hơn thế nữa, tất cả mật số của vi khuẩn bình nhiệt và ái nhiệt thủy phân tinh bột, cellulose và protein ở ngày 15 đều có giá trị cao nhất (Bảng 4.6).
Bảng 4.7: So sánh mật số 3 nhóm vi khuẩn bình nhiệt và ái nhiệt theo nghiệm thức – log (CFU/g) Nghiệm thức CV% Môi trường tinh bột CV% Môi trường cellulose CV% Môi trường protein Nhóm bình nhiệt Đối chứng 8,78 6,49ab 12,44 6,27b 5,92 6,69b Chế phẩm 1 4,71 6,20a 8,97 5,80a 7,47 7,15b Chế phẩm 2 12,93 6,97c 11,67 5,62a 15,90 6,48a Chế phẩm 3 8,81 6,66b 11,01 6,92c 14,20 7,40b Nhóm ái nhiệt Đối chứng 6,93 1,12a 5,16 1,23a Chế phẩm 1 2,15 2,69b 2,56a 3,19 1,39a Chế phẩm 2 4,85 4,07c 7,75 4,19c 11,30 3,59b Chế phẩm 3 9,55 4,13c 11,87 3,96b 8,37 4,11c
Những số theo sau cùng một chữ thì khơng khác biệt có ý nghĩa 5%
Khi so sánh mật số của ba chế phẩm với mật số của đối chứng, hầu hết mật số ba nhóm vi khuẩn bình nhiệt và ái nhiệt của chế phẩm 2 và 3 cao hơn có ý nghĩa so với đối chứng và chế phẩm 1, ngoại trừ mật số vi khuẩn bình nhiệt thủy phân cellulose và protein. Đặc biệt, chế phẩm 3 có mật số phân bố khá đều hơn so với chế phẩm 2 (Bảng 4.7).
4.3.4 Khối lƣợng rác hữu cơ sụt giảm
Kết quả đánh giá dựa vào tỉ lệ khối lượng rác hữu cơ sụt giảm của bốn nghiệm thức tại ba thời điểm được trình bày ở Bảng 4.8. Tỉ lệ rác sụt giảm của các nghiệm thức ở ngày 10 và 15 cao hơn ngày 5 (ngoại trừ nghiệm thức đối chứng). Thêm vào đó, tỉ lệ rác hữu cơ sụt giảm của các nghiệm thức ở ngày 15 đều cao hơn ngày 10.
Bảng 4.8: Tỉ lệ rác hữu cơ sụt giảm ở 4 nghiệm thức theo thời thời gian
Ngày CV % Đối chứng Chế phẩm 1 Chế phẩm 2 Chế phẩm 3
5 36,67 2,39a 5,63a 5,72a 7,24a
10 32,39 3,97a 9,25b 9,37b 9,82b
15 16,40 9,25a 10,57c 12,25c 12,9c
Mặc khác, qua kết quả cũng xác định được tỉ lệ khối lượng rác sụt giảm ở các nghiệm thức cao hơn so với đối chứng (Bảng 4.9).
Bảng 4.9: Độ hiệu quả của chế phẩm lên mẻ ủ rác 10 kg
Nhiệm thức Đối chứng Chế phẩm 1 Chế phẩm 2 Chế phẩm 3 Tỉ lệ khối lượng rác sụt giảm 5,20 a 58,40b 9,61c 10,18d CV % 60,23 24,37 31,28 28,14
Qua bảng 4.9 ghi nhận chế phẩm 2 cho hiệu quả xử lý cao hơn chế phẩm 1 và chế phẩm 2 cho hiệu quả xử lý cao hơn chế phẩm 3. Rõ ràng có tác động mãnh mẽ giữa các dịng vi khuẩn bình nhiệt và ái nhiệt.
4.4 Nhận diện nhóm vi khuẩn thủy phân carbohydrate và protein
Sáu dòng A2, A4, C2, C5, P1 và P4 được chọn để tiến hành phản ứng PCR khuếch đại trình tự 16S rRNA với cặp mồi 27F và 1492R, sản phẩm của phản ứng được kiểm tra thông qua điện di gel agarose. Kết quả cho thấy các dòng vi khuẩn này đều thể hiện băng ở vị trí khoảng 1500 bp so với thang chuẩn 100 bp plus (Hình 4.7). Do đó, cặp mồi này đã khuếch đại thành cơng trình tự 16S rRNA.
Hình 4.7: Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của 6 dòng vi khuẩn được tuyển chọn trên gel agarose 1,5%
Ghi chú: 1- thang chuẩn 100 bp plus, 2- A2, 3- A4, 4- C2, 5- C5, 6- P1, 7- P4
Trong đó, chỉ có 4 dịng vi khuẩn A4, C2, P1 và P4 được giải trình tự đoạn gen 16S rRNA. Kết quả giải trình tự các dịng có khả năng thủy phân carbohydrate và protein được thể hiện ở Bảng 4.10.
Bảng 4.10: Thống kê kết quả giải trình tự các dịng có khả năng thủy phân carbohydrate và protein
STT
Dòng vi khuẩn phân lập
Tương đồng với dòng vi khuẩn trên ngân hàng NCBI
Tỉ lệ tương đồng di truyền 1 A4 Burkholderia sp. A13 và Burkholderia
cenocepacia strain CRIDA PSB3
99%
2 C2 Aeribacillus pallidus strain CCMMB1008, Bacillus licheniformis strain CCMMB842
và Geobacillus pallidus strain: L33-1
99%
3 P1 Azospirillum amazonense strain CBAmc và Azospirillum amazonense strain Am 14
98%
Azospirillum sp. PT6C 97%
4 P4 Acinetobacter sp. U1369-101122-SW178-2,
Acinetobacter radioresistens strain wx3 và Acinetobacter radioresistensstrain SEIP 12.31
99% 1500 bp
Kết quả phân tích 4 chủng vi khuẩn này trong cây phả hệ cho thấy các dòng F46 (A4) và L19 (P1) cùng nằm trên một nhánh của cây phả hệ nên có mối quan hệ gần gũi với nhau về mặt di truyền (nhóm B, Hình 4.8). Dịng L20 (P4) và L22 (C2) ở một nhánh khác trên phả hệ (nhóm A) chứng tỏ khơng có quan hệ gần gũi với 2 dòng trên.
Ghi chú: Nhánh A thể hiện mối liên hệ giữa hai dịng bình nhiệt, nhánh B thể hiện mối liên hệ giữa hai dịng ái nhiệt
Hình 4.8: Cây phả hệ trình bày mối quan hệ di truyền của 4 dịng vi khuẩn dựa trên trình tự 16S rRNA và bằng phần mềm MEGA 6.06
4.5 Thảo luận
4.5.1 Tuyển chọn các nhóm vi khuẩn bình nhiệt và ái nhiệt
a. Nhóm vi khuẩn bình nhiệt và ái nhiệt thủy phân carbohydrate
Ở mỗi dòng vi khuẩn có hoạt tính cao vào từng thời điểm khác nhau. Điều này cũng cho thấy vào khoảng ngày 8 đến ngày 10, khả năng thủy phân của các dòng C1, C2, C3 và C5 đạt cao nhất, ngoại trừ dòng C4 đạt giá trị cao nhất vào ngày 6. Thời điểm mẫu C2 có hoạt tính enzyme cao nhất vào ngày 9 (0,26 U/ml), trong khi thời điểm xác định của tác giả Gupta et al. (2011) với
KF879225_Bacillus_licheniformis_strain_CCMMB842 AB548614_Geobacillus_pallidus_strain:_L33-1 KF879315_Aeribacillus_pallidus_strain_CCMMB1008 L22 JQ082154_Acinetobacter_sp._U1369-101122-SW178-2 KF891406_Burkholderia_sp._SR2-07 GU458288_Azospirillum_sp._PT6C L20 HM485596_Azospirillum_amazonense_strain_CBAmc NR_104981_Azospirillum_amazonense_strain_Am_14 L19 KF963620_Acinetobacter_radioresistens_strain_wx3 HE651925_Acinetobacter_radioresistens_strain_SEIP_12.31 F46 JX310700_Burkholderia_cenocepacia_strain_CRIDA_PSB3 100 100 99 55 99 80 35 68 62 100 51 0.5 Neighbor-joining Nhánh A Nhánh B
hoạt tính enzyme cao nhất vào ngày 4 là 0,16 U/ml đối với vi khuẩn và Pirzadah et al. (2014) là 3,65 U/ml vào ngày 8 đối với nấm. Bên cạnh đó, yếu tố pH và nhiệt độ phản ứng tác động đến hoạt tính enzyme của mỗi nhóm vi sinh vật sẽ khác nhau. Điều này được làm rõ dựa theo kết quả của Salin et al. (2012), hoạt tính cellulase của Aspergillus niger thu được cao nhất là 0,35 U/ml khi ủ hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ 50oC và pH 4,5-5,5. Tương tự với điều kiện phản ứng enzyme của A. anitratus và Branhamella sp. với cơ chất CMC trong điều kiện pH 4,8 ở 50oC và thời gian phản ứng là 1giờ thu được hoạt tính là 2,56 và 0,34 U/ml (Pratima et al., 2011).
Đối với các dịng thủy phân tinh bột có sự đánh giá khác hơn các dòng thủy phân CMC là do 2 dòng A1 và A5 có lượng glucose trong mẫu cao nhưng lại khơng thể hiện hoạt tính. Điều này cho thấy, enzyme ngoại bào của 2 mẫu này hoạt động không tốt. Theo Nguyễn Đức Lượng (2004), quá trình trao đổi chất qua màng tế bào diễn ra đồng thời. Các đường đa được thủy phân thành các đường đơn thẩm thấu vào bên trong tế bào vi khuẩn và tiếp tục tham gia vào quá trình đường phân, quá trình tổng hợp vật chất của cơ thể. Tuy nhiên, việc di chuyển của các nhóm đường đơn này phụ thuộc vào điều kiện bên trong và ngoài tế bào. Lê Thanh Hải (2013) cũng đã khẳng định quá trình trao đổi chất được xem như hệ thống mở của sinh vật đối với môi trường xung quanh. Điều này giải thích vì sao lượng đường trong mẫu thu được cao nhưng lại không thể hiện hoạt tính của enzyme ngoại bào. Hơn thế nữa, các dịng được nghiên cứu có đặc điểm chung là thời điểm có hoạt tính mạnh nhất dao động khoảng ngày 3 đến ngày 5, trong khi lượng đường đạt giá trị cao nhất vào 3 ngày cuối (ngoại trừ mẫu A4). Điều này phù hợp với quá trình trao đổi chất của tế bào.
b. Nhóm vi khuẩn bình nhiệt và ái nhiệt thủy phân protein
Sáu dịng vi khuẩn này thể hiện hoạt tính cao nhất dao động vào ngày 5 đến ngày 8 với giá trị dao động khoảng 7,22 đến 10,81 U/ml. Giá trị này cao hơn khoảng 10-12 lần so với giá trị của các chủng Bacillus (Võ Hồng Thi và
ctv., 2012). Theo nghiên cứu này, protease của các chủng Bacillus đã được phân lập có hoạt tính cao nhất dao động khoảng 1 – 1,15 U/ml trong điều kiện tối thích của enzyme này với pH 7, nhiệt độ phản ứng 50oC và thời gian thu enzyme thô là ngày 3. Một kết quả nghiên cứu khác của Nguyễn Châu Sáng và
ctv. (2014) tìm ra điều kiện tối ưu ở pH 9 và 45oC, hoạt tính serine protease của chủng Bacillus sp.SV1 đạt cao nhất là 0,75 U/ml.
4.5.2 Nhận diện 4 dịng vi khuẩn
với trình tự DNA của Burkholderia sp. A13 và Burkholderia cenocepaciastrain CRIDA PSB3. Theo các nghiên cứu cho thấy Burkhoderia
được phân bố khá rộng và đóng góp lớn trong xử lý mơi trường cũng như y học. Burkholderia được nghiên cứu từ rất lâu và cho đến nay giống vi khuẩn này tiếp tục được nghiên cứu và ứng dụng ở nhiều lĩnh vực như y học, nông nghiệp và xử lý môi trường. Theo Gillis et al. (1995), chủng Burkholderia Vietnamiensis được phân lập từ các ruộng lúa có khả năng cố định Nitơ, có
mối liên hệ gần với B.cepacia. Ngồi ra, chủng này cịn được phân lập từ máu, cổ của trẻ em. Sự phân bố của chi Burkholderia khá rộng trong hệ sinh thái như đất, nước, nước thải, rác thải và sinh vật (Gillis et al., 1995; Vandamme, 2003; Compant et al., 2008; Cao Ngọc Điệp và ctv., 2015). Hơn thế nữa, một
vài lồi thuộc Burkholderia cũng được phát hiện có khả năng hút ion kim loại, tiết
enzyme ngoại bào, tiết độc tố hoặc kháng sinh (Lee et al., 2000; Vial et al., 2007
và Jiang et al., 2008). Trong đó, Lee et al. (2000) mô tả chủng Burkholderia pseudomallei là vi khuẩn gram âm, được tìm thấy nhiều trong đất và nước ở
Nam Á và phía Bắc Châu Úc, tiết ra các yếu tố nguy hiểm tiềm ẩn như enzyme ngoại bào protease, hemolysin, lipase and lecithinase và gây bệnh truyền nhiễm ngoài da.
Đoạn DNA của dịng vi khuẩn P1 (960 Nu) có tỉ lệ tương đồng di truyền 98% với Azospirillum amazonense strain CBAmc, Azospirillum amazonense
strain Am 14 v à 97% với Azospirillum sp. PT6C. Các chủng vi khuẩn này thuộc họ Rhodospirillaceae. Theo nghiên cứu của Lasseur et al. (2000), nhóm vi khuẩn dị dưỡng hay quang dị dưỡng được chọn để xử lý rác hữu cơ là họ Rhodospirillaceae, chi Rhodobacter như Rhodobacter capsulatus và chi
Rhodospirillum như Rhodospirillum rubrum. Một nghiên cứu khác về vi
khuẩn quang dưỡng Rhodospirillum rubrum khi khảo sát hoạt động của enzyme hydrolase trong môi trường sau 4 ngày nuôi cấy cao gấp 10 lần so với dịch chiết thô của tế bào (Hiura et al., 1979). Ngồi ra, dịng vi khuẩn Azospirillum sp. đã được Oh et al. (1999) xác định là có khả năng tiết enzyme
ngoại bào. Enzyme này hoạt động tích cực trong khoảng pH 8,5 và nhiệt độ trên 40oC. Ở nhiệt đô dưới 30oC, enzyme này hoạt động ổn định trong 3 ngày.
Đoạn DNA của dòng vi khuẩn P4 (1200 Nu) có tỉ lệ tương đồng di truyền 99% với Acinetobacter sp. U1369-101122-SW178-2, Acinetobacter radioresistens strain wx3 và Acinetobacter radioresistens strain SEIP 12.31.
Có khá nhiều nghiên cứu về khả năng thủy phân carbohydrate và protein của vi khuẩn Acinetobacter sp. (Gurunathan et al., 2010). Acinetobacter Baumannii có khả thủy phân tích cực tinh bột và protein. Sự phát triển tế bào
trong điều kiện pH 8 và nhiệt độ 37o
nhất đạt 165 μg/ml. Trong đó, Salwan et al. (2013) đã tìm thấy enzyme peptidase của chủng Acinetobacter sp. MN 12 MTCC có hoạt tính đặc hiệu
2,03 mg/ml với điều kiện pH 9 và nhiệt độ khoảng tách chiết 4-60oC.
Đoạn DNA của dòng vi khuẩn C2 (1091 Nu) có tỉ lệ tương đồng di truyền 99% với Aeribacillus pallidus strain CCMMB1008, Bacillus licheniformis strain CCMMB842 và Geobacillus pallidus strain: L33-1. Có
nhiều nghiên cứu về khả năng của Bacillus tiết ra enzyme thủy phân cơ chất carbohydrate và protein. Ling et al. (2012) cho rằng hoạt tính cellulase mạnh nhất khi ủ vi khuẩn Bacillus thuringiensis ở 28oC trong môi trường LB với 1%
CMC.Trong khi đó, cellulase chịu được nhiệt độ từ vi khuẩn Geobacillus
subterraneus (Assareh et al., 2012) đạt hoạt tính 143,5 U/ml sau 24h với điều
kiện cơ chất là 0.5% Tween 80, pH 6,5 và nhiệt độ 50oC.
4.5.3 Ứng dụng 6 dòng tuyển chọn trên rác hữu cơ ủ trong bình 10 Kg