Hoạt tính enzyme được xác định dựa vào lượng tyrosine thu được sau phản ứng. Lượng tyrosine được xác định dựa vào đường chuẩn tyrosine với giá trị OD 280 nm đo được sau phản ứng (Kunitz, 1947). Đơn vị hoạt tính enzyme trong 1 ml dung dịch enzyme được tính theo cơng thức:
40 µl cystein, 140 µl đệm phosphat và 20 µl enzim 600 µl TCA 40 µl cystein, 140 µl đệm phosphat và 20 µl enzim 600 µl casein ủ 20 phút, 37oC ủ 20 phút, 37oC Lắc ủ 10 phút, 37oC Lắc ủ 10 phút, 37oC 600 µl casein 600 µl TCA Ổn định 4oC, 10phút Ổn định 4oC, 10phút Ly tâm 13000rpm, 10 phút và đo OD 280 nm Ly tâm 13000rpm, 10 phút và đo OD 280 nm
* *1000 * * hh E V V x Tu k T . Trong đó:
Tu: hoạt tính enzyme (Tu/ml)
x: nồng độ Tyrosine (µmol/ml), được xác định bằng đường chuẩn Tyrosine Vhh: thời gian phản ứng (10 phút)
VE: thể tích enzyme (20 µl) k: hệ số pha lỗng
Phương trình đường chuẩn tyrosine dựa trên kết quả thí nghiệm tại PTN Enzyme, Viện NC&PT CNSH là y= 1,325x + 0,005) với R2 0,998.
3.3.4 Mô tả và nhận diện vi khuẩn 3.3.4.1 Mô tả vi khuẩn
Quan sát khuẩn lạc trên môi trường đặc: chọn những khuẩn lạc rời ở cuối đường cấy và tương đối đồng đều nhau, quan sát hình dạng, dạng bìa, màu sắc và kích thước của khuẩn lạc.
Quan sát tế bào dưới kính hiển vi quang học: nhỏ 50 µl nước cất vơ trùng lên kính mang vật đã được làm sạch và vô trùng, kim cấy cũng được hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội. Dùng kim cấy lấy vi khuẩn từ ống nghiệm, trải đều trên kính và dùng miếng lame đậy lại. Quan sát mẫu từ vật kính 10, rồi chuyển sang vật kính 40. Quan sát và ghi nhận hình dạng tế bào vi khuẩn.
3.3.4.2 Nhận diện vi khuẩn
Nhận diện vi khuẩn bằng phản ứng PCR và thực hiện điện di gel chứa sản phẩm PCR.
a) Phản ứng PCR
Sau khi ly trích DNA từ các dòng vi khuẩn, thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen 16S rRNA với cặp mồi tổng (Universal 16S rRNA Primers, Eden et al., 1991; Wilson et al., 1990). Trong đó,
8F 5’ –AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG- 3’ Eden et al., 1991 1492R 5’ –TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3 Wilson et al., 1990
Tiến hành trộn mix cho phản ứng PCR trong các tube. Thành phần cho 1 phản ứng PCR với tổng thể tích là 25 µl, bao gồm: 11,75 µl H2O; 2,5 µl Buffer có (NH4)2SO4; 2 µl MgCl2; 4 µl dNTP; 0,5 µl DMSO; 0,25 µl primer 8F; 0,25 µl primer 1492 R; 0,25µl Taq DNA polymerase và 2µl DNA vi
Quy trình phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn: giai đoạn tách mạch ở 95oC trong 5 phút, giai đoạn nhân bản: 30 chu kỳ (95o
C trong 1 phút, 53oC trong 30 giây và 72oC trong 1 phút 30 giây), giai đoạn hoàn tất (72o
C trong 5 phút và 10oC ∞). Cuối cùng đem trữ sản phẩm khuếch đại ở 4oC cho đến khi sử dụng.
b) Điện di gel chứa sản phẩm PCR
Quy trình điện di được thực hiện theo các bước sau:
- Bước 1: đổ gel agarose 1,2% vào 40 ml dung dịch TAE 1X đối với gel 17 giếng vào khuôn. Sau 1 giờ, khuôn gel được đặt vào bể điện di chứa dụng dịch đệm TAE 1X sao cho các giếng trên gel phải ngập trong dung dịch đệm.
- Bước 2: load mẫu vào các giếng bằng cách dùng micropipet trộn đều 2 µl mẫu sản phẩm PCR với 8 µl chất chỉ thị màu Safe view. Sau đó, điện di ở 50 V trong 30 phút bằng bộ điện di một chiều. Khi thấy chất chị thị màu di chuyển đến gần giữa đường đen của gel thì tắt nguồn. Lấy khuôn gel ra khỏi bể điện di và chụp hình gel.
- Bước 3: Chụp hình gel đã điện di bằng hệ thống chụp hình gel Bio-Rad Universal Hood II. Sau đó, quan sát các band DNA xuất hiện trên gel và xác định vi khuẩn cần tìm bằng cách so sánh độ dài các band DNA của vi khuẩn phân lập với độ dài band DNA của thang chuẩn.
Sản phẩm PCR được gửi cho MACROGEN (Hàn Quốc) để giải trình tự bằng máy giải trình tự tự động và sử dụng dữ liệu trên ngân hàng gen (GeneBank database) của NCBI bằng phần mềm BLAST N để đánh giá tỉ lệ đồng hình 16S rRNA của các dịng vi khuẩn đã được tuyển chọn so với các dịng trên ngân hàng gen. Sau đó, đánh giá mối liên hệ di truyền của các dòng vi khuẩn vừa xác định trình tự dựa vào trình tự gene 16S rRNA bằng phần mềm MEGA 6.06.
3.3.5 Khảo sát khả năng thủy phân rác hữu cơ trong bình 10 kg đối với các dòng vi khuẩn đã đƣợc tuyển chọn
3.3.5.1 Mục đích thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện nhằm đưa một số dòng vi khuẩn sau khi được tuyển chọn trong phịng thí nghiệm trở lại môi trường rác hữu cơ tự nhiên trong điều kiện có thể kiểm sốt so với rác hữu cơ thực tế được lấy về từ bãi rác. Điều này sẽ khẳng định lại khả năng phân hủy carbohydrate và protein của những dòng được chọn.
Trước tiên, rác hữu cơ được thu thập từ các chợ bao gồm phế phẩm động thực vật các loại. Thành phần rác hữu cơ gồm: 53 kg phế phẩm thực vật (rau, củ, quả) và 10,5 kg phế phẩm động vật (ruột cá, đầu cá, vỏ cua). Xử lý sơ bộ rác này trước khi bố trí thí nghiệm bằng cách làm nhỏ kích thước của rác sao cho phù hợp với bình 10 kg.
Tiến hành bố trí thí nghiệm theo kiểu bố trí hồn tồn ngẫu nhiên 1 nhân tố chế phẩm vi khuẩn, 4 nghiệm thức (đối chứng, nhóm bình nhiệt - CP1, nhóm ái nhiệt - CP2 và hỗn hợp 2 nhóm này - CP3) và 3 lần lặp lại. Đối chứng là mẻ ủ rác không trộn chế phẩm. Chế phẩm được trộn hỗn hợp ba dòng vi khuẩn thủy phân protein, tinh bột và cellulose theo tỉ lệ 3:7:10.
Trước khi cho hỗn hợp rác đã chuẩn bị vào bình, hỗn hợp rác này sẽ được trộn đều mỗi chế phẩm theo từng nghiệm thức khác nhau. Sau đó, rác sẽ được nén chặt vào bình kín có lỗ thốt nước.
Mẻ ủ sẽ được khảo sát trong 10 ngày.
3.3.5.3 Các chỉ tiêu theo dõi a) Nhiệt độ mẻ ủ rác
- Nhiệt độ được đo mỗi ngày vào buổi trưa bằng nhiệt kế 100oC.
- Cách đo: ghi nhận nhiệt độ mơi trường bên ngồi bình và bên trong bình ở mỗi ngày đo.
b) pH từ nƣớc rỉ rác của mẻ ủ
Thu mẫu nước từ mẻ ủ rác mỗi ngày và ghi nhận giá trị pH.
c) Mật số ba nhóm vi khuẩn bình nhiệt và ái nhiệt trong mẻ ủ rác
- Việc đếm mật số được thực hiện vào ngày 3, ngày 5 và ngày 10. Mật số được đưa về dạng log (CFU/g)
- Xác định khối lượng vật chất khô của mẫu đem đi đếm mật số: mẫu được đem đi sấy khô ở 105o
C trong 2 ngày. Mẫu sau sấy được để vào bình hút ẩm trong 30 phút trước khi cân. Ghi nhận khối lượng mẫu ướt và mẫu sau khi sấy để xác định ẩm độ của mẫu rác vào 3 thời điểm nêu trên. Công thức xác định ẩm độ:
- Thực
hiện đếm mật số bằng phương pháp đếm sống (Hoben và Somasegaran, 1982).
(a b) *100%
A a
Trong đó, A là phần trăm ẩm độ a là khối lượng mẫu ướt
1g mẫu được hòa tan trong 9 ml nước cất vơ trùng. Sau đó, mẫu hịa tan được pha loãng đến 10-4
vào ngày 5, ngày 10 và pha loãng đến 10-5 vào ngày 15. Nhỏ 10µl vào đĩa mơi trường chọn lọc. Ủ trong 48h, sau đó ghi nhận kết quả. Cơng thức tính mật số khuẩn lạc trung bình theo cơng thức:
Trong đó, A: số khuẩn lạc trung bình/ml k: hệ số pha loãng
d) Tỉ lệ khối lƣợng rác sụt giảm
- Cân bình vào ba thời điểm: ngày 5, ngày 10 và ngày 15 để xác định khối lượng rác sụt giảm
- Cơng thức tính tỉ lệ khối lượng rác sụt giảm:
3.4 Xử lý số liệu
Tất cả số liệu được xử lý trên phần mềm excel và phân tích bằng phần mềm SPSS 16. Các biến được phân tích theo ANOVA, Multi Univerate để xác định sự khác biệt ý nghĩa giữa các giá trị trung bình bằng các phương pháp so sánh Duncan với mức ý nghĩa p<0,05.
3.4.1 Giá trị hoạt tính (U/ml)
- Số liệu với 3 lần lặp lại. Trong đó, thí nghiệm theo kiểu bố trí 1 nhân tố (vi khuẩn) với 5 nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát giá trị hoạt tính amylase và cellulase; 6 nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát giá trị hoạt tính protease. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Thời gian khảo sát là 10 ngày.
- Xử lý thống kê: so sánh các giá trị trung bình theo Anova để xác định thời điểm giá trị trung bình đạt cao nhất và so sánh giá trị trung bình cao nhất của mỗi dịng.
3.4.2 Nhiệt độ mẻ ủ rác (oC) và pH của nƣớc rỉ rác
- Thí nghiệm được bố trí theo kiểu 1 nhân tố (vi khuẩn) với 4 nghiệm thức và 3 lần lặp lại. Thời gian khảo sát là 15 ngày.
- Xử lý thống kê: so sánh các giá trị trung bình theo ANOVA để đánh giá sự thay đổi theo ngày và theo nghiệm thức.
3.4.3 Mật số 3 nhóm vi khuẩn bình nhiệt và ái nhiệt trong mẻ ủ rác
- Thí nghiệm được bố trí theo kiểu 1 nhân tố (vi khuẩn) với 4 nghiệm Mật số vi khuẩn/ml = A * k
m (a i)*100%
a b
Trong đó: m là tỉ lệ khối lượng rác sụt giảm a là khối lượng rác ban đầu
thức và 3 lần lặp lại. Thời gian khảo sát ở 3 thời điểm và trên 3 loại môi trường.
- Xử lý thống kê đa biến: Univariate để xét xem có sự tương tác giữa nghiệm thức và ngày ở từng loại môi trường (từng loại vi khuẩn).
(B)
Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn bình nhiệt và vi khuẩn ái nhiệt từ rác hữu cơ trên 3 loại môi trƣờng chọn lọc cơ trên 3 loại môi trƣờng chọn lọc
Từ mẫu rác hữu cơ được thu thập tại các bãi rác ở thành phố Cần Thơ, tiến hành phân lập được 83 dịng vi khuẩn có khả năng thủy phân carbohydrate và protein. Trong đó, 23 dịng vi khuẩn thủy phân tinh bột, 22 dòng vi khuẩn thủy phân CMC và 28 dòng vi khuẩn thủy phân protein. Nhìn chung, tốc độ phát của phần lớn các dịng vi khuẩn bình nhiệt phát triển khá tốt sau 24 giờ, trong khi phần lớn các dòng vi khuẩn ái nhiệt phát triển chậm hơn. Đặc biệt, các dịng vi khuẩn bình nhiệt thủy phân protein có kích thước khuẩn lạc đa dạng và to hơn kích thước của các nhóm vi khuẩn khác được nghiên cứu; kích thước khuẩn lạc của vi khuẩn thủy phân CMC khá nhỏ.
Kết quả đánh giá định tính, tuyển chọn được 5 dịng vi khuẩn thủy phân tinh bột (A1, A2, A3, A4, A5), 5 dòng vi khuẩn thủy phân CMC (C1, C2, C3, C4, C5) và 6 dịng vi khuẩn thủy phân protein trên mơi trường dịch chiết bò và sữa tươi (P1, P2, P3, P4, P5 và P6). Tất cả các dòng vi khuẩn được phân lập đều có tế bào dạng hình que và có khả năng chuyển động, ngoại trừ dịng A2 và P6 là không chuyển động. Đặc biệt, tế bào dòng P4 chuyển động rất nhanh.
Đặc điểm khuẩn lạc phát triển trên môi trường tinh bột thạch agar có dạng trịn đều, màu trắng đục hoặc vàng, độ nổi mơ, độ bóng trơn, kích thước khoảng 10-30mm; đặc điểm khuẩn lạc phát triển trên mơi trường CMC thạch agar có dạng trịn đều, màu trắng, trắng trong hoặc vàng, độ nổi mơ, độ bóng