CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Mục tiêu 2:
2.2.3. Thiết kế phương pháp nghiên cứu
a. Thiết kế nghiên cứu:
Nghiên cứu phân tích thực nghiệm tại thực địa và phịng thí nghiệm:
22
được từ mục tiêu 1 để thử nhạy cảm với hóa chất diệt cơn trùng theo WHO. - Xác định vai trò truyền bệnh của muỗi Anopheles bằng kỹ thuật mổ muỗi xác định ký sinh trùng và kỹ thuật PCR xác định ký sinh trùng trong muỗi.
b. Cỡ mẫu nghiên cứu:
- Thử nhạy cảm ít nhất 01 lồi (ưu tiên véc tơ chính An. dirus) với 01 hóa
chất (alphacypermethrin). Thu thập đủ 150 mẫu muỗi của 01 lồi để thử cho 01 hóa chất.
- Tối thiểu 100 mẫu muỗi để xác định ký sinh trùng sốt rét.
c. Phƣơng pháp chọn mẫu:
Muỗi cho thử nhạy cảm là muỗi thu thập từ các phương pháp Bẫy màn bằng mồi người trong nhà, ngoài nhà và soi chuồng gia súc ban đêm. Muỗi sau khi thu thập được hút nước đường Glucose 10% để đảm bảo độ đồng đều. Trước khi thử nghiệm phải lựa chọn những con muỗi khỏe, đủ chân cánh.
d. Nội dung nghiên cứu
- Xác định độ nhạy cảm của muỗi với một số hóa chất diệt cơn trùng bằng phương pháp thử sinh học theo quy trình của WHO (2016).
- Xác định thoa trùng trong muỗi bằng kỹ thuật mổ muỗi xác định thoa trùng theo quy trình của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trung trung ương. Tiến hành mổ muỗi tại thực địa.
- Xác định KSTSR bằng kỹ thuật PCR theo quy trình của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trung trung ương tại phịng thí nghiệm.
e. Phƣơng pháp xác định biến số và đo lƣờng biến số
- Số lượng muỗi nhiễm ký sinh trùng.
- Số lượng muỗi ngã trong thời gian 1 giờ tiếp xúc với hóa chất, số muỗi chết sau 24 thời theo dõi của thử nhạy cảm.
- Số lượng muỗi sống, chết sau 24 giờ thử nhạy cảm.
f. Phiếu thu thập số liệu nghiên cứu
Biểu mẫu kết quả mổ muỗi xác định ký sinh trùng.
Biểu mẫu thử nhạy cảm in sẵn. Biểu mẫu gồm các thông tin như: thời gian, địa điểm, lồi muỗi thử, hóa chất thử nghiệm, số lượng muỗi ngã theo thời gian, tỷ lệ muỗi chết sau 24 giờ thử nghiệm.
23
g. Các chỉ số đánh giá
- Tỷ lệ thoa trùng được tính theo cơng thức sau:
Số lượng muỗi có ký sinh trùng
Tỷ lệ thoa trùng = x 100 Tổng số muỗi được mổ
- Thử nhạy cảm của muỗi có 3 mức độ đánh giá: Nhạy cảm, có thể kháng và kháng dựa trên tỷ lệ muỗi chết sau 24 giờ thử.
h. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
- Kỹ thuật thử nhạy cảm:
Muỗi trưởng thành thuộc giống Anopheles thu thập ngoài thực địa được tiến hành thử nhạy cảm các bước theo quy trình của WHO(2016).
Bước 1. Chuẩn bị ống nghỉ
Lấy một tờ giấy trắng sạch có kích thước 12 x 15 cm, ghi lên tờ giấy các thông tin cần thiết trên giấy, dùng kẹp bằng đồng để giữ cho tờ giấy ép sát vào thành ống.
Bước 2. Cho muỗi vào ống nghỉ
Cho 25 con muỗi vào một ống nghỉ, trong đó có 04 ống thử và 02 ống đối chứng
Bước 3. Muỗi nghỉ trước khi tiếp xúc với giấy tẩm hoá chất
Sau khi đã cho đủ muỗi vào 06 ống, để ống nghỉ ở tư thế thẳng đứng với đầu ống có lưới hướng lên trên trong thời gian 1 giờ.
Bước 4. Chuẩn bị ống tiếp xúc
Cho vào mỗi ống tiếp xúc một tờ giấy tẩm hoá chất cần thử: cuộn tờ giấy tẩm thành hình trụ và lồng vào ống tiếp xúc. Dùng kẹp bằng đồng để giữ cho tờ giấy ép sát vào thành ống.
Bước 5. Chuyển muỗi từ ống nghỉ sang ống tiếp xúc
Lắp ống tiếp xúc vào tấm đế của ống nghỉ (trong ống nghỉ đã có muỗi) Thổi hết sức nhẹ nhàng vào ống nghỉ để muỗi bay từ ống nghỉ sang ống tiếp xúc.
Bước 6. Muỗi tiếp xúc với giấy tẩm hoá chất
Để ống tiếp xúc (có muỗi ở trong) ở vị trí thẳng đứng với đầu ống có lưới hướng lên phía trên trong thời gian là 60 phút, ghi lại số muỗi ngã theo biểu mẫu.
24
Bước 7. Chuyển muỗi từ ống tiếp xúc sang ống nghỉ
Ngay sau khi kết thúc thời gian tiếp xúc, chuyển muỗi từ ống tiếp xúc sang ống nghỉ
Bước 8. Muỗi nghỉ sau tiếp xúc
Giữ ống nghỉ trong vòng 24 giờ ở nơi tách biệt, mát mẻ với nhiệt độ điều kiện nhiệt độ 250C ± 20C và độ ẩm là 80% ± 10%. Ghi nhiệt độ tối đa và tối thiểu ở nơi để ống nghỉ trong khoảng thời gian theo dõi (24 giờ).
+ Nếu tỷ lệ muỗi chết trong lô đối chứng > 20%, hủy bỏ kết quả và làm lại thử nghiệm.
+ Nếu tỷ lệ muỗi đối chứng chết trong khoảng 5%- 20%, tỷ lệ muỗi chết được điều chỉnh theo công thức Abott
+ Nếu tỷ lệ muỗi chết trong lô đối chứng < 5%, giữ nguyên tỷ lệ chết quan sát mà không cần điều chỉnh.
Công thức Abott:
Tỷ lệ (%) muỗi chết thử nghiệm - tỷ lệ (%) muỗi chết ĐC
Tỷ lệ (%) muỗi chết = x 100
100 - tỷ lệ (%) muỗi chết ĐC
+Nếu tỷ lệ muỗi chết 98 - 100%: muỗi nhạy cảm với hóa chất thử nghiệm. + Nếu tỷ lệ muỗi chết 90 ≤ 97%: muỗi có thể kháng với hóa chất thử nghiệm. + Nếu tỷ lệ muỗi chết < 90%: muỗi kháng với hóa chất thử nghiệm.
- Kỹ thuật mổ muỗi tìm thoa trùng trong tuyến nước bọt [36]:
Chuẩn bị mẫu:
+ Gây mê hoặc giết muỗi cái trưởng thành bằng Chloroform. + Định loại và ghi chép các thông tin về muỗi được mổ.
+ Cắt phần cánh và chân muỗi (có thể cho vào ống Beem capsult nhỏ, đánh
dấu và giữ thông tin và sử dụng phần này để định loại bằng PCR).
+ Sau đó có thể mổ tuyến nước bọt theo phương pháp: Đặt muỗi lên lam kính, để phần đầu về phía tay phải, dùng kim nhọn cắt bỏ phần đầu đi, nhỏ một giọt nhỏ nuớc muối sinh lý gần với phía trước ngực của muỗi. Dùng kim đầu tù ở tay trái giữ chặt phần ngực, từ từ ấn phần ngực muỗi bằng kim ở tay phải để
25
đẩy tuyến ra khỏi ngực. Dùng kim nhọn chuyển tuyến nước bọt vào giọt nước muối đã chuẩn bị từ trước, bỏ phần thân muỗi vào Beem capsult trên. Đặt lam men có kích thước 18 x 18 mm lên trên tuyến nước bọt.
+ Kiểm tra kết quả sau khi mổ: Sau khi phủ lam men lên tuyến nước bọt, dùng kim mổ gõ nhẹ đều lên trên lam men, để làm vỡ tuyến nước bọt, giải thoát thoa trùng. Soi kiểm tra kết quả dưới vật kính 40 X. Thoa trùng được ghi nhận có hình con thoi, mảnh, khúc xạ ánh sáng, đôi khi chúng chuyển động ngọ nguậy chậm.
+ Chuẩn bị Giêm sa để nhuộm: Pha 5 ml dung dịch Giêm sa mẹ với 95 ml dung dịch đệm PBS pH = 7,2.
+ Nhuộm tiêu bản thoa trùng: Dùng đầu kim, nhẹ nhàng tách lam men ra và
lật ngược nó lại để mặt ướt lên trên, dùng gơm gắn tạm thời lam men này lên trên bề mặt lam kính. Bằng cách này sẽ giữ được những thoa trùng dính trên lam men và nhuộm màu chúng. Dùng bút chì mỡ khoanh trịn vùng có thoa trùng ở mặt trái của lam để đánh dấu, để lam khô tự nhiên. Cố định tiêu bản bằng cách nhúng toàn bộ lam vào dung dịch methanol vài giây. Nhuộm bằng dung dịch Giêm sa 5% trong 30 phút. Rửa sạch thuốc nhuộm và kiểm tra dưới kính hiển vi vật kính dầu. Thoa trùng sẽ có hình con thoi mảnh bắt màu xanh nước biển ở giữa có nhân (điểm nhiễm sắc thể màu đỏ).
+ Làm tiêu bản cố định: Sau khi rửa bằng dung dịch đệm để lam tiêu bản khô tự nhiên. Nhỏ một giọt gôm gắn như Euparal, DPX ... vào vị trí có tiêu bản. Lật ngược lammen áp vào phần có thoa trùng và để nó khơ tự nhiên.
- Kỹ thuật xác định ký sinh trùng trong muỗi bằng PCR
Quy trình kỹ thuật tách chiết ADN từ mẫu muỗi trưởng thành.
+ Làm tan đá dung dịch EB ở nhiệt độ 65oC trên máy lắc ủ nhiệt khô trong 5 phút.
+ Ly tâm ống đựng mẫu ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong 10 giây.
+ Cho từ từ 50 µl dung dịch tách chiết EB vào ống đựng mẫu, nghiền mẫu bằng chày nghiền chuyên dụng.
26
+ Ủ mẫu ở 65oC trên máy lắc ủ nhiệt khô với tốc độ lắc 900 chu kỳ/phút trong 30 phút.
+ Ly tâm mẫu ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong 10 giây. + Chuyển ống đựng mẫu vào giá đựng mẫu lạnh.
+ Cho từ từ 7 µl Kac 8M vào ống đựng mẫu, trộn nhẹ dung dịch bằng Micropipet theo vòng tròn từ trên xuống dưới đáy ống.
+ Chuyển giá lạnh đựng mẫu vào ngăn đá trong 30 phút. + Lấy giá lạnh đựng mẫu ra khỏi ngăn đá.
+ Ly tâm các ống đựng mẫu ở 4oC với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 20 phút. + Chuyển dịch nổi sang ống nhựa 1,5ml mới đã ghi ký hiệu mẫu tương ứng. + Cho 100 µl cồn Ethanol tuyệt đối lạnh vào ống đựng mẫu.
+ Chuyển giá đựng mẫu vào ngăn đá trong 5 phút.
+ Ly tâm ống đựng mẫu ở 4oC với tốc độ 13.200 vòng/phút trong 20 phút. + Dùng Micropipet hút bỏ dịch nổi.
+ Cho 150 µl cồn Ethanol 70% lạnh vào ống đựng mẫu.
+ Ly tâm các ống đựng mẫu ở 4oC với tốc độ 13.200 vòng/phút trong 5 phút. + Dùng Micropipet hút bỏ dịch nổi.
+ Cho 150 µl cồn Ethanol tuyệt đối lạnh vào ống đựng mẫu.
+ Ly tâm ống đựng mẫu ở 4oC với tốc độ 13.200 vòng/phút trong 5 phút. + Dùng Micropipet hút bỏ hoàn toàn dịch nổi.
+ Mở các nắp ống đựng mẫu, để khơ ở nhiệt độ phịng trong 30 phút. + Hòa tan ADN bằng 50 µl dung dịch TE.
+ Bảo quản ADN thu được ở nhiệt độ dưới - 200C cho đến khi sử dụng. Quy trình phát hiện ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật realtime PCR
27
Plasmodium
spp. Sequences
PAN- R TGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAA
PAN- F TTAGATTGCTTCCTTCAGTRCCTTATG
PAN- Probe FAM-TCAATTCTTTTAACTTTCTCGCTTGCGCGA-
BHQ1 P. falciparum Fal-F CTCTTCAATATGCTTTTATTGCTTTTGAGA Fal-R GCTTATTCATATTTGTTATTCCATGCTGTA Fal-Probe FAM-ACAATGAACTCAATCATGACTACCC-BHQ1 P.vivax Vix-F ACGCTTCTAGCTTAATCCACATAACT Viv-R TAATTTACTCAAAGTAACAAGGACTTCCAA Vix-Probe HEX-TCGTATCGACTTTGTGCGCATTTTGT-BHQ1 P.malariae Mal-F GTAATGCTTTGTATATTTATAACAAAGTTG Mal-R CTCAAAGTAACAAAATTCCCATGCATAA Mal-Probe NED - ATAATAAGAACGCAT - MGB NFQ
P.ovale
Oval-F ATACMACGTATCTGYTCTTTGC
Oval-R ACTCAAAGTAACAAAATCTCCWGTAA
Oval-Probe VIC- TCCAAAATGTGTTCTTATTA - MGB NFQ
P.knowlesi
Know-F GCATCATAATCCAGTTTTATG Know-R TACCTTGTACCTAATAATACTTGG
28
-Điều kiện và thành phẩn phản ứng qPCR phát hiện các loài KSTSR:
Thành phần phản ứng Thể tích cho 1 phản ứng (µl)
2X quantinova probe mix 10
Mồi xi (25µM) 0,3 Mồi ngược_(25µM) 0,3 Đầu dị (10µM) 0,8 H2O 3,9 ADN mẫu 5 Tổng số 20 - Chu trình phản ứng
Bước 1: Hoạt hóa 95°C, 3 phút
Bước 2: Nhân bản 95°C, 5 giây
45 chu kì 58°C, 30 giây
i. Phƣơng pháp kiểm soát nhiễu và sai số trong nghiên cứu
Số liệu thu thập được ghi trên biểu mẫu bằng giấy và máy tính.
Tọa độ các điểm điều tra được kiểm tra trùng khớp với địa điểm trên Google map.
j. Phƣơng pháp phân tích và xử lý số liệu:
Xử lý và làm sạch số liệu bằng phần mềm Excell. Phân tích để đưa ra các chỉ số: Tỷ lệ muỗi chết trong thử nhạy cảm, tỷ lệ nhiễm thoa trùng trong muỗi.
k. Đạo đức trong nghiên cứu
Nghiên cứu tuân thủ nghiêm ngặt các Quy định trong nghiên cứu y, sinh học.
29