CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.3. Các phương pháp phân tích sắc ký
2.3.3.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng là một phương pháp phân tách lý - hóa trong đó các chất được tách ra khỏi một hỗn dựa trên sự “phân bố” liên tục của chúng giữa 2 pha, một pha không chuyển động (pha tĩnh) thường là silica gel, aluminium oxit được phủ trên một mặt phẳng chất trơ và một pha chuyển động (pha động) bao gồm dung dịch cần phân tích được hịa tan trong một dung mơi thích hợp và được hút lên bản sắc ký bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch.
Một số cải tiến có thể kết hợp phương pháp truyền thống để tự động hóa một vài bước, làm tăng độ dung giải của sắc ký lớp mỏng và cho số liệu chính xác hơn. Phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (high performance TLC - HPTLC).
Chuẩn bị sắc ký
Bản sắc ký được làm bằng cách trộn chất hấp phụ, như silica gel, với một lượng nhỏ chất trơ để kết dính, như canxi sulfat (thạch cao), và nước. Hỗn hợp này được trải ra như một lớp vữa đặc trên một bề mặt chất trơ, như thủy tinh, nhôm, hoặc nhựa. Bản sắc ký này sẽ được để khơ và kích hoạt bằng cách nung nóng trong lị trong 30 phút ở nhiệt độ 110 °C. Độ dày của lớp hấp phụ thường là 0.1-0.25 mm cho hóa học phân tích, và khoảng 1-2 mm cho sắc ký lớp mỏng dự bị. Trong mọi kĩ thuật sắc ký đều bao gồm 1 pha động và 1 pha tĩnh.
Kỹ thuật
Phương pháp tiến hành giống với sắc ký giấy với lợi thế là nhanh hơn, tách hỗn hợp hiệu quả hơn, và có sự lựa chọn giữa các "pha tĩnh" khác nhau. Bởi tính
đơn giản và nhanh, sắc ký lớp mỏng thường được dùng để giám sát các phản ứng hóa học và phân tích chất lượng sản phẩm của phản ứng.
Một vệt nhỏ dung dịch chứa mẫu thử được thấm lên bản sắc ký, khoảng 1 cm từ dưới lên. Bản sắc ký sau đó được nhúng vào một dung mơi thích hợp, như ethanol hoặc nước, và được đặt vào trong một vật chứa có nắp. Dung mơi di chuyển lên bản sắc ký bởi mao dẫn, gặp phải mẫu thử và dịch chuyển mẫu thử lên bản sắc ký. Các hợp chất khác nhau trong hỗn hợp mẫu thử dịch chuyển với tốc độ khác nhau do chúng có sức hút khác nhau đối với pha tĩnh, và độ tan khác nhau trong dung môi.
Các hợp chất được tách ra dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động để có được chỗ liên kết với pha tĩnh. Thí dụ, nếu silica gel được dùng như pha tĩnh, nó được xem là phân cực. Cho trước 2 hợp chất có tính phân cực khác nhau, chất nào có tính phân cực lớn hơn sẽ có sự liên kết với silica gel lớn hơn và vì thế sẽ có khả năng đẩy pha động ra khỏi các chỗ liên kết. Do đó, hợp chất có tính phân cực nhỏ hơn sẽ di chuyển lên cao hơn trên bản sắc ký (kết quả là hệ số
lưu Rf sẽ lớn hơn). Nếu pha động được thay bằng một dung môi phân cực hơn
hoặc là một hỗn hợp các dung mơi, nó sẽ có khả năng để đẩy các chất tan ra khỏi chỗ liên kết với silica gel, và tất cả các hợp chất trên bản sắc ký sẽ dịch chuyển lên cao hơn. Trên thực tế, nếu chúng ta dùng một hỗn hợp ethyl axetat và heptane như là pha động, tăng thêm ethyl acetate sẽ cho hệ số lưu Rf cao hơn cho tất cả các hợp chất trên bản sắc ký. Thay đổi độ phân cực của pha động sẽ khơng làm các hợp chất có thứ tự di chuyển ngược lại trên bản sắc ký. Nếu muốn có một thứ tự ngược lại trên bản sắc ký, một pha tĩnh không phân cực sẽ được sử dụng, như là C18-chức năng hóa silica.
Hình 2.2: Sắc khí bản mỏng khi chấm và chạy trong dung mơi
Dung mơi thích hợp dùng trong sắc ký lớp mỏng sẽ là một dung mơi có tính phân cực khác với pha tĩnh. Nếu một dung mơi phân cực được dùng để hịa tan mẫu thử trên một pha tĩnh phân cực, vệt nhỏ mẫu thử sẽ lan tròn do mao dẫn, và
các vệt khác nhau có thể trộn lẫn vào nhau. Do đó, để hạn chế sự lan trịn của các vệt mẫu, dung mơi được sử dụng để hịa tan mẫu thử phải không phân cực, hoặc phân cực một phần, nếu pha tĩnh phân cực, và ngược lại.
Hệ số lưu Rf của mỗi vệt mẫu sẽ được xác định bằng cách chia khoảng cách di chuyển được của hợp chất cho khoảng cách di chuyển được của dung môi. Những số liệu này phụ thuộc vào các loại dung môi được sử dụng và các loại bản sắc ký, và không phải là hằng số.
2.3.3.2. Phương pháp sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột là một dạng của sắc ký bản mỏng. Trong sắc ký cột, chất hấp phụ pha tĩnh được nhồi trong các ống hình trụ gọi là “cột”. Nhờ vậy mà có thể triển khai nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến mạnh. Giống như sắc ký lớp mỏng, phương pháp này cũng dựa vào độ phân cực của các chất, những chất có ái lực lớn hơn đối với chất hấp phụ sẽ ra khỏi cột chậm hơn và những chất có ái lực yếu hơn sẽ ra khỏi cột nhanh hơn trong 15 quá trình sắc ký. Sự tách trong cột xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ hoặc phân bố tùy theo tính chất của chất được sử dụng làm cột.
Chuẩn bị chất hấp phụ và cột: Silica gel phải được hoạt hóa ở 120°C trong
4 giờ trước khi đưa lên cột. Cột sắc ký phải là một khối đồng nhất, phải thật khô và lắp thẳng đứng trên một giá cố định vững chắc.
Nhồi cột: Chất hấp phụ phải được phân tán đồng đều trong cột. Có 2 cách
nhồi cột: nhồi khô và nhồi ướt với dung môi. Sau khi đơn chất hấp phụ lên cột, rót dung mơi vào cột và để chạy liên tục một thời gian để ổn định cột và không được để khô dung môi trong cột.
Đưa chất cần phân tách lên cột: Phải đưa chất lên cột sao cho chất phân
tán thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột bằng phẳng. Có nhiều cách đơn chất lên cột: phương pháp dùng đĩa giấy, cho thẳng dung dịch chất cần phân tách lên cột, trộn chất cần phân tách với một lượng chất hấp phụ…
Rửa cột: Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà áp
dụng cách rửa cột bằng áp suất thường hoặc áp xuất nén. Hứng dịch chảy ra ở đáy cột theo phân đoạn, theo thời gian hoặc bằng ống nghiệm cùng thể tích.
Hình 2.3: Sắc ký cột 2.3.4. Tạo phân đoạn từ các cặn chiết 2.3.4. Tạo phân đoạn từ các cặn chiết
Cặn chiết EtOAc của củ Ráy dại (350 g) được phân tách sơ bộ trên cột silica gel với hệ dung môi rửa giải là n-hexan/aceton gradient rồi đến hệ aceton/MeOH gradient, thu được 10 phân đoạn ký hiệu từ F1 đến F10. Quá trình tạo các phân đoạn của cặn chiết này được trình bày ở Sơ đồ 2.
Sơ đồ 2. Sơ đồ tạo các phân đoạn từ cặn chiết EtOAc của củ Ráy dại
2.3.5. Phân lập chất từ dịch chiết củ Ráy dại (Alocasia odora K. Koch)
Sử dụng phương pháp sắc kí cột và sắc ký lớp mỏng điều chế để phân lập các chất. Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường cỡ hạt 40 - 60µm và cột sephadex LH 20. Sắc ký lớp mỏng điều chế được thực hiện trên bản mỏng silica gel GF254, phát hiện vết chất bằng ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 365nm. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập bằng sắc ký lớp mỏng với một số hệ dung môi phù hợp.
Cặn chiết EtOAc của củ Ráy dại (350 g) được phân tách sơ bộ trên cột
silica gel với hệ dung môi rửa giải là n-hexan/Aceton gradient rồi đến hệ aceton/MeOH gradient, thu được 10 phân đoạn ký hiệu từ F1 đến F10. Quá trình phân lập các chất sạch của cặn chiết EtOAc được trình bày ở Sơ đồ 3.
Từ phân đoạn F5 (3 g), phân tách trên cột sillica gel gradient CH2Cl2/MeOH (0-100 %) thu được 5 phân đoạn nhỏ, kí hiệu từ F5.1-F5.5. Từ phân đoạn nhỏ F5.2 (220 mg), tiếp tục phân tách trên cột LH-20 thu 5 phân đoạn nhỏ F5.2.1- F5.2.5. Điều chế bản mỏng sắc kí hệ CH2Cl2/MeOH (9/1) phân đoạn F5.2.2 thu được chất AO5 (12 mg). Điều chế bản mỏng sắc kí hệ CH2Cl2/MeOH (9/1) phân đoạn F5.2.3 thu được chất AO2 (12 mg). Từ phân đoạn nhỏ F5.3 (200 mg), tiếp tục phân tách trên cột LH-20 thu 4 phân đoạn nhỏ F5.3.1-F5.3.4. Cô khô phân đoạn F5.2.2 thu được chất AO1 (8 mg).
2.3.6. Các phương pháp xác định cấu trúc
Phương pháp chung để phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất là sự kết hợp giữa các phương pháp phổ hiện đại bao gồm: phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR và DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) để nhận dạng và xác định cấu trúc hóa học của các chất được phân lập.
Phổ khối lượng (Mass spectrometry - MS)
Khối phổ là một trong các phương pháp thường được sử dụng để xác định khối lượng phân tử của chất nghiên cứu dựa vào sự phát hiện ra ion phân tử [M]+, [M+H]+…, từ đó giúp xây dựng công thức phân tử.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ NMR là phương pháp hiện đại trong việc phân tích cấu trúc các hợp chất hóa học, dựa trên nguyên tắc cộng hưởng của các hạt nhân của các nguyên tử khi được đặt trong một từ trường. Trong phổ NMR có hai thơng số có đặc trưng liên quan đến cấu trúc hóa học của một phân tử là độ dịch chuyển hóa học δ và hằng số tương tác spin – spin J. Từ các dữ liệu phân tích các phổ 1D và 2D NMR cho phép xây dựng cấu trúc phân tử của mẫu đo.
Các hợp chất sau khi được tinh chế bằng các phương pháp sắc ký sẽ được tiến hành đo phổ NMR. Trước tiên, các hợp chất sẽ được đo phổ proton 1H-NMR. Nếu chất đảm bảo đủ độ tinh khiết sẽ được tiến hành đo tiếp phổ cacbon 13C-NMR và DEPT. Với những hợp chất có cấu trúc đơn giản, hay gặp có thể xác định được cấu trúc chỉ với số liệu cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR và DEPT). Với các chất phức tạp hơn thì cần tiến hành đo thêm các phổ NMR hai
chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY), phổ IR, phổ X-ray để cung cấp thêm thông tin cho việc xác định cấu trúc. Hợp chất sau khi đã được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ đã nêu sẽ được khẳng định công thức phân tử dựa trên kết quả phổ MS hoặc phổ HRMS.
Dữ liệu phổ của hợp chất AO1
Chất rắn màu trắng, ESI-MS: m/z 343 [M+H]+. 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) δH (ppm): 6.81 (1H, dd, J = 2.0, 8.5 Hz, H-6’/H- 6’’), 7.31 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-7’/H-7’’), 7.74 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-4’/H-4’’), 7.92 (1H, s, H-2’/H-2’’), 8.96 (1H, s, H-3/H-6). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δC (ppm): 106.2 (C-4’/C-4’’), 113.2 (C-7’/C-7’’), 113.3 (C-6’/C-6’’), 113.9 (C-3’/C-3’’), 126.7 (C-2’/C-2’’), 127.4 (C-9’/C-9’’), 133.6 (C-8’/C-8’’), 141.5 (C-3/C-6), 148.4 (C-2/C-5), 152.8 (C-5’/C-5’’).
Dữ liệu phổ của hợp chất AO2
Chất rắn màu trắng, ESI-MS: m/z 321 [M+H]+. 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) δH (ppm): 6.85 (1H, dd, J = 2.5, 8.5 Hz, H- 6’/H-6’’), 7.34 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-7’/H-7’’), 7.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-4’/H- 4’’), 8.04 (1H, s, H-2’/H-2’’). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δC (ppm): 107.5 (C-4’/C-4’’), 113.7 (C- 7’/C-7’’), 114.2 (C-3’/C-3’’), 114.5 (C-6’/C-6’’), 128.5 (C-9’/C-9’’), 132.9 (C- 8’/C-8’’), 138.5 (C-2’/C-2’’), 155.0 (C-5’/C-5’’), 191.2 (C-10’/C-10’’).
Dữ liệu phổ của hợp chất AO5
Chất rắn màu trắng, ESI-MS: m/z 344 [M+H]+. 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) δH (ppm): 6.84 (1H, dd, J = 2.5, 8.5 Hz, H- 6’), 7.16 (1H, dd, J = 2.5, 8.5 Hz, H-7), 7.35 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-7’), 7.57 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-8), 7.60 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-5), 8.04 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-4’), 8.18 (1H, d, J = 5.0 Hz, H-4), 8.45 (1H, d, J = 5.0 Hz, H-3), 8.91 (1H, s, H-2’). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δC (ppm): 106.8 (C-5), 108.0 (C-4’), 113.3 (C-7’), 113.9 (C-6’), 113.9 (C-8), 116.1 (C-3’), 118.5 (C-4), 119.9 (C-7), 122.6
(C-4b), 129.8 (C-3’a), 132.4 (C-7’a), 132.5 (C-4a), 137.4 (C-3), 137.4 (C-8b), 137.5 (C-8a), 139.1 (C-2’), 140.4 (C-1), 152.6 (C-6), 154.4 (C-5’), 189.9 (C-8’).
2.3.7. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học
2.3.7.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym xanthine oxidase
Axit uric là sản phẩm cuối của q trình chuyển hóa purin trong cơ thể. Đây là một axit yếu, nên thường được ion hóa thành muối urat hịa tan trong huyết tương và dịch ngoại bào. Việc sản xuất axit uric được xúc tác bởi enzyme xanthine oxidase (XO) ở gan, nó đóng vai trị quan trọng trong quá trình oxy hoá hypoxanthine thành xanthine và oxy hoá xanthine thành axit uric. Dựa vào mối liên quan mật thiết giữa nồng độ axit uric máu và enzym XO đối với bệnh gút, nên ức chế enzym XO là một trong những cơ chế chính mà các thuốc phịng và điều trị gút đang hướng tới.
Nguyên lý
Xanthin oxidase (XO) xúc tác cho q trình oxy hóa xanthin thành axit uric:
Phương pháp đánh giá tác dụng ̣ức chế xanthin oxidase được triển khai theo phương pháp của Noro trên đĩa 96 giếng và được điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm.
Tiến hành thí nghiệm
Trên mỡi đĩa 96 giếng gờm có: Hỗn hợp phản ứng ban đầu gồm 200 µL chứa XO 0,0125 U và các nồng độ khác nhau của chất thử, được ủ ở nhiệt độ phịng (25ºC) trong 30 phút. Sau đó, phản ứng được bổ sung 100 µL xanthine 0,5 mM và được tiếp tục ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Dừng phản ứng bằng HCl 1N. Hỗn hợp phản ứng sau cùng được đo độ hấp thụ bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 290 nm. Allopurinol được dùng là chất tham chiếu. Phép thử được lặp lại 3 lần.
Axit uric tạo thành sau phản ứng được đánh giá thông qua đo độ hấp thụ quang (OD). Sự giảm gía trị OD ở giếng có mẫu thử so với giếng đối chứng phản ánh mức độ ức chế hoat động của enzym XO.
Đánh giá kết quả : Tính I (% ức chế) theo công thức: I (%) = (∆ODc - ∆ODt)/ ∆ODc x 100
trong đó: ∆ODc = ODchứng – ODtrắng; ∆ODt = ODthử - ODtrắng
Giá trị phần trăm ức chế được biểu diễn dưới dạng trị số trung bình. Giá trị IC50 của mẫu thử được tính tốn bằng phương pháp hồi quy sử dụng phần mềm Microsoft Excel Table curve dựa vào mối quan hệ giữa phần trăm ức chế và nồng độ thử nghiệm.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP 3.1.1. Hợp chất AO1 (Alocasin A) 3.1.1. Hợp chất AO1 (Alocasin A)
Hợp chất AO1 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng. Phổ khối ESI- MS của AO1 cho pic ion giả phân tử ở m/z 343 [M+H]+.
Hình 3.1. Phổ MS của hợp chất AO1
Trên phổ 1H-NMR xuất hiện các tín hiệu của một hệ ABX ở δH 6.81 (1H, dd, J = 2.0, 8.5 Hz), 7.31 (1H, d, J = 8.5 Hz), 7.74 (1H, d, J = 2.0 Hz) và 2 proton thơm singlet ở δH 7.92 (1H, s), 8.96 (1H, s). Phổ 13C-NMR và HSQC cho tín hiệu của 10 nguyên tử carbon tương ứng với 5 nhóm methin sp2 ở δC 106.2 (C-4’/C- 4’’), 113.2 (C-7’/C-7’’), 113.3 (C-6’/C-6’’), 126.7 (C-2’/C-2’’), 141.5 (C-3/C-6) và 5 carbon không liên kết trực tiếp với hydro ở δC 113.9 (C-3’/C-3’’), 127.4 (C- 9’/C-9’’), 133.6 (C-8’/C-8’’), 148.4 (C-2/C-5), 152.8 (C-5’/C-5’’) (Bảng 3.1). Các dữ liệu phổ MS, NMR gợi ý cấu trúc của AO1 có cấu trúc đối xứng. Độ
chuyển dịch hóa học của các carbon C-2/C-5 (δC 148.4), C-8’/C-8’’ (δC 133.6), C- 3/C-6 (δC 141.5), C-5’/C-5’’ (δC 152.8) gợi ý sự liên kết của các carbon này với các nguyên tử oxy và nitơ.
Bảng 3.1. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất AO1 và chất tham khảo
C Hợp chất AO1 Alocasin A
≠
δCa,b δH(độ bội, J = Hz)a,c δCa,d
2, 5 148,4 148,4 3, 6 141,5 8,96 s 141,5 2’, 2’’ 126,7 7,92 s 126,7 3’, 3’’ 113,9 113,9 4’, 4’’ 106,2 7,74 d (2,0) 106,2 5’, 5’’ 152,8 - 152,8 6’, 6’’ 113,3 6,81 d (2,0; 8,5) 113,3 7’, 7’’ 113,2 7,31 d (8,5) 113,2 8’, 8’’ 133,6 133,6 9’, 9’’ 127,4 127,4
Ghi chú: aĐo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz, d75 MHz, ≠ [17]
Hình 3.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất AO1
Hình 3.5. Một số tương tác chính trên phổ HMBC của hợp chất AO1
Các mảnh cấu trúc sau đó được kết nối nhờ phân tích phổ HMBC. Tương tác HMBC giữa H-4’/H-4’’ (δH 7.74) với C-6’/C-6’’ (δC 113.3), C-8’/C-8’’ (δC 133.6), và C-5’/C5’’ (δC 152.8); tương tác giữa H-6’/H-6’’ (δH 6.81) với C-4’/C4’’ (δC 106.2); tương tác giữa H-7’/H-7’’ (δH 7.31) với C-5’/C5’’ (δC 152.8) và tương tác giữa H-2’/H-2’’ (δH 7.92) với C-3’/C3’’ (δC 113.9), C-8’/C8’’ (δC 133.6), C- 9’/C9’’(δC 127.4) cho phép xác nhận cấu trúc của vòng indole thế ở 2 vị trí C-3 và C-5. Tương tác xa trên phổ HMBC giữa proton H-3/H-6 và H-2’/H-2’’ với C-