CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.5. Phân lập chất từ dịch chiết củ Ráy dại (Alocasia odora K Koch)
Sử dụng phương pháp sắc kí cột và sắc ký lớp mỏng điều chế để phân lập các chất. Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường cỡ hạt 40 - 60µm và cột sephadex LH 20. Sắc ký lớp mỏng điều chế được thực hiện trên bản mỏng silica gel GF254, phát hiện vết chất bằng ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 365nm. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập bằng sắc ký lớp mỏng với một số hệ dung môi phù hợp.
Cặn chiết EtOAc của củ Ráy dại (350 g) được phân tách sơ bộ trên cột
silica gel với hệ dung môi rửa giải là n-hexan/Aceton gradient rồi đến hệ aceton/MeOH gradient, thu được 10 phân đoạn ký hiệu từ F1 đến F10. Quá trình phân lập các chất sạch của cặn chiết EtOAc được trình bày ở Sơ đồ 3.
Từ phân đoạn F5 (3 g), phân tách trên cột sillica gel gradient CH2Cl2/MeOH (0-100 %) thu được 5 phân đoạn nhỏ, kí hiệu từ F5.1-F5.5. Từ phân đoạn nhỏ F5.2 (220 mg), tiếp tục phân tách trên cột LH-20 thu 5 phân đoạn nhỏ F5.2.1- F5.2.5. Điều chế bản mỏng sắc kí hệ CH2Cl2/MeOH (9/1) phân đoạn F5.2.2 thu được chất AO5 (12 mg). Điều chế bản mỏng sắc kí hệ CH2Cl2/MeOH (9/1) phân đoạn F5.2.3 thu được chất AO2 (12 mg). Từ phân đoạn nhỏ F5.3 (200 mg), tiếp tục phân tách trên cột LH-20 thu 4 phân đoạn nhỏ F5.3.1-F5.3.4. Cô khô phân đoạn F5.2.2 thu được chất AO1 (8 mg).
2.3.6. Các phương pháp xác định cấu trúc
Phương pháp chung để phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất là sự kết hợp giữa các phương pháp phổ hiện đại bao gồm: phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR và DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) để nhận dạng và xác định cấu trúc hóa học của các chất được phân lập.
Phổ khối lượng (Mass spectrometry - MS)
Khối phổ là một trong các phương pháp thường được sử dụng để xác định khối lượng phân tử của chất nghiên cứu dựa vào sự phát hiện ra ion phân tử [M]+, [M+H]+…, từ đó giúp xây dựng công thức phân tử.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ NMR là phương pháp hiện đại trong việc phân tích cấu trúc các hợp chất hóa học, dựa trên nguyên tắc cộng hưởng của các hạt nhân của các nguyên tử khi được đặt trong một từ trường. Trong phổ NMR có hai thơng số có đặc trưng liên quan đến cấu trúc hóa học của một phân tử là độ dịch chuyển hóa học δ và hằng số tương tác spin – spin J. Từ các dữ liệu phân tích các phổ 1D và 2D NMR cho phép xây dựng cấu trúc phân tử của mẫu đo.
Các hợp chất sau khi được tinh chế bằng các phương pháp sắc ký sẽ được tiến hành đo phổ NMR. Trước tiên, các hợp chất sẽ được đo phổ proton 1H-NMR. Nếu chất đảm bảo đủ độ tinh khiết sẽ được tiến hành đo tiếp phổ cacbon 13C-NMR và DEPT. Với những hợp chất có cấu trúc đơn giản, hay gặp có thể xác định được cấu trúc chỉ với số liệu cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR và DEPT). Với các chất phức tạp hơn thì cần tiến hành đo thêm các phổ NMR hai
chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY), phổ IR, phổ X-ray để cung cấp thêm thông tin cho việc xác định cấu trúc. Hợp chất sau khi đã được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ đã nêu sẽ được khẳng định công thức phân tử dựa trên kết quả phổ MS hoặc phổ HRMS.
Dữ liệu phổ của hợp chất AO1
Chất rắn màu trắng, ESI-MS: m/z 343 [M+H]+. 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) δH (ppm): 6.81 (1H, dd, J = 2.0, 8.5 Hz, H-6’/H- 6’’), 7.31 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-7’/H-7’’), 7.74 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-4’/H-4’’), 7.92 (1H, s, H-2’/H-2’’), 8.96 (1H, s, H-3/H-6). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δC (ppm): 106.2 (C-4’/C-4’’), 113.2 (C-7’/C-7’’), 113.3 (C-6’/C-6’’), 113.9 (C-3’/C-3’’), 126.7 (C-2’/C-2’’), 127.4 (C-9’/C-9’’), 133.6 (C-8’/C-8’’), 141.5 (C-3/C-6), 148.4 (C-2/C-5), 152.8 (C-5’/C-5’’).
Dữ liệu phổ của hợp chất AO2
Chất rắn màu trắng, ESI-MS: m/z 321 [M+H]+. 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) δH (ppm): 6.85 (1H, dd, J = 2.5, 8.5 Hz, H- 6’/H-6’’), 7.34 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-7’/H-7’’), 7.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-4’/H- 4’’), 8.04 (1H, s, H-2’/H-2’’). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δC (ppm): 107.5 (C-4’/C-4’’), 113.7 (C- 7’/C-7’’), 114.2 (C-3’/C-3’’), 114.5 (C-6’/C-6’’), 128.5 (C-9’/C-9’’), 132.9 (C- 8’/C-8’’), 138.5 (C-2’/C-2’’), 155.0 (C-5’/C-5’’), 191.2 (C-10’/C-10’’).
Dữ liệu phổ của hợp chất AO5
Chất rắn màu trắng, ESI-MS: m/z 344 [M+H]+. 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) δH (ppm): 6.84 (1H, dd, J = 2.5, 8.5 Hz, H- 6’), 7.16 (1H, dd, J = 2.5, 8.5 Hz, H-7), 7.35 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-7’), 7.57 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-8), 7.60 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-5), 8.04 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-4’), 8.18 (1H, d, J = 5.0 Hz, H-4), 8.45 (1H, d, J = 5.0 Hz, H-3), 8.91 (1H, s, H-2’). 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) δC (ppm): 106.8 (C-5), 108.0 (C-4’), 113.3 (C-7’), 113.9 (C-6’), 113.9 (C-8), 116.1 (C-3’), 118.5 (C-4), 119.9 (C-7), 122.6
(C-4b), 129.8 (C-3’a), 132.4 (C-7’a), 132.5 (C-4a), 137.4 (C-3), 137.4 (C-8b), 137.5 (C-8a), 139.1 (C-2’), 140.4 (C-1), 152.6 (C-6), 154.4 (C-5’), 189.9 (C-8’).