Khảo sát các điều kiện định lượng Amoxicillin

CHƯƠNG 2 : THỰC NGHIỆM

2.2. Nội dung nghiên cứu

2.2.1. Khảo sát các điều kiện định lượng Amoxicillin

Tất cả các thử nghiệm được thực hiện trong phòng thí nghiệm với điều kiện: nhiệt độ 25 ± 10C, độ ẩm: 50 – 55 %RH.

❖ Lựa chọn vùng phổ hồng ngoại để định lượng Amoxicillin

- Sấy KBr ở 1050C đến khối lượng không đổi.

- Mẫu chuẩn: cân chính xác 4,0 mg chuẩn Amoxicillin, đồng nhất với 196mg KBr, nén thành viên có đường kính 13 mm, nén viên với áp suất 800 Mpa trong điều kiện chân không.

- Mẫu thử: cân bột thuốc tương ứng 4,0 mg Amoxicillin, đồng nhất với 196,0 mg KBr và tiến hành ép viên tương tự mẫu chuẩn.

- Các mẫu tá dược: 3 viên nén độc lập chứa mỗi tá dược: Natri croscarmellose, Natri lauryl sulfat và Magie stearat. Với nồng độ 1,0 mg/viên. (1,0 mg của mỗi thành phần được đồng nhất với 199,0 mg KBr và tiến hành tương tự mẫu thử và mẫu chuẩn).

- Quét phổ của các mẫu ở vùng từ 4000 đến 400 cm-1.

- So sánh phổ thu được từ mẫu chuẩn, mẫu thử và các mẫu tá dược.

- Lựa chọn vùng phổ đặc trưng của Amoxicillin mà không bị ảnh hưởng bởi các tá dược để tiến hành định lượng Amoxicillin.

❖ Khảo sát tỉ lệ khối lượng mẫu /KBr

- Tiến hành trộn chất chuẩn Amoxicillin với KBr theo tỷ lệ khối lượng mẫu trên KBr là x/y với x= 1→10 và y = 100 - x.

- Lựa chọn tỷ lệ có độ hấp thụ phù hợp với điều kiện phân tích.

- Theo yêu cầu của phép đo quang phổ trong các dược điển, độ hấp thụ nên nằm trong khoảng 0.2 đến 0.8 và càng gần 0.43 càng tốt [1],[19].

❖ Khảo sát khối lượng mẫu dùng để nén viên và độ lặp lại của quá trình

nén viên

Lượng mẫu ép viên ảnh hưởng đến bề dày viên, do đó có ảnh hưởng trực tiếp đến độ hấp thụ quang của hoạt chất. Để thu được viên nén có đường kính 13 mm, tiến hành khảo sát lượng mẫu dùng ép viên để thu được viên nén bền, chắc, đồng nhất và có độ hấp thụ phù hợp.

2.2.2. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

Tiến hành xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích với các thơng số: tính tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, độ ổn định và độ chọn lọc, theo các yêu cầu của AOAC.

❖ Độ tuyến tính

- Chuẩn bị các viên chuẩn có nồng độ khác nhau.

- Đo độ hấp thụ, xây dựng đường hồi quy tuyến tính, tính hệ số tương quan và

phân tích phương sai để xác định sự phù hợp dựa trên kết quả khảo sát của 3 ngày khác nhau.

❖ Độ chụm

Độ chụm được đánh giá dựa trên độ lặp lại (trong ngày) và độ chính xác trung gian (giữa các ngày phân tích).

- Độ lặp lại: đồng nhất KBr và mẫu thử Amoxicillin theo tỷ lệ đã khảo sát. Ép

thành 06 viên nén khác nhau, đo độ hấp thụ trong cùng điều kiện phịng thí nghiệm và cùng một ngày. Xác định hàm lượng Amoxicillin trong mẫu thử. Tính giá trị độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) giữa các kết quả thu được.

- Hàm lượng Amoxicillin được tính theo cơng thức:

𝐻𝐿(%) = 𝐴𝑇 𝐴𝐶× 𝑚𝐶 × 𝐻𝐿𝐶 × 𝑚̅ 𝑚𝑇× 100 𝐻𝐿𝑁 (1) Trong đó: + AT là độ hấp thụ của viên thử; + AC: độ hấp thụ của viên chuẩn;

+ mC: khối lượng Amoxicillin trong viên chuẩn (mg); + mT: khối lượng bột thuốc trong viên thử (mg); + HLC: hàm lượng của chất chuẩn (%);

+ 𝑚̅: khối lượng trung bình của mẫu thử (mg);

+ HLN: hàm lượng Amoxicillin ghi trên nhãn của mẫu thử (mg).

- Độ chính xác trung gian giữa các ngày được thực hiện bằng cách phân tích lặp

lại 06 mẫu thử Amoxicillin vào hai ngày khác nhau, ở cùng điều kiện thí nghiệm. Tương quan về hàm lượng Amoxicillin trong mẫu thử giữa các ngày khác nhau được đánh giá bằng phân tích phương sai ANOVA.

❖ Độ đúng

Chuẩn bị các viên nén thử thêm chuẩn ở ba mức nồng độ R1, R2 và R3 tương ứng 80, 100 và 120% nồng độ làm việc của phương pháp, mỗi nồng độ được tiến hành 3 lần.

Đo chiều cao độ hấp thụ của các mẫu thử thêm chuẩn. Tính KL Amoxicillin định lượng được theo cơng thức (1).

Tính KL chuẩn thu hồi và tỷ lệ thu hồi:

KL chuẩn thu hồi (mg) = KL Amoxicillin định lượng (mg) – KL Amoxicillin trong mẫu thử (mg)

𝑇ỷ⁡𝑙ệ⁡𝑡ℎ𝑢⁡ℎồ𝑖⁡(%) = ⁡ 𝐾𝐿⁡𝑐ℎ𝑢ẩ𝑛⁡𝑡ℎ𝑢⁡ℎồ𝑖⁡(𝑚𝑔)

❖ Tính chọn lọc

Tính chọn lọc được phân tích để xác minh khả năng của phương pháp định lượng thuốc khi có mặt các tá dược trong dạng bào chế của viên nang. Phương pháp được sử dụng đã được mô tả trong phần lựa chọn vùng phổ hồng ngoại để định lượng Amoxicillin.

❖ Độ ổn định

Các thơng số được đánh giá: nhiệt độ của phịng làm việc (250C và 300C), thời gian nén của viên (± 2 phút so với thời gian nén làm việc), và hãng sản xuất KBr (Merck và Prolabo).

Tiến hành phân tích lặp lại 06 lần mẫu thử Amoxicillin trong mỗi điều kiện trên. Đánh giá kết quả dựa trên so sánh các điều kiện thí nghiệm bằng t-test.

❖ Độ khơng đảm bảo đo của phương pháp

Hiện nay, có nhiều phương pháp tính độ khơng đảm bảo đo của phương pháp thử nghiệm. Tuy nhiên trong phương pháp định lượng này, việc phân tích dự trên kết quả so sánh chuẩn – thử trong cùng điều kiện phịng thí nghiệm. Để đánh giá độ không đảm bảo đo của phương pháp, ta bỏ qua các ảnh hưởng của điều kiện phịng thí nghiệm.

Do đó, độ khơng đảm bảo đo của phương pháp được tính dựa trên kết quả thẩm định độ đúng và độ thu hồi (đánh giá độ không đảm bảo đo theo phương pháp Top – Down).

ubias = ; RMSbias =

u = U = 2u (3)

Trong đó:

U: ĐKĐBĐ mở rộng (độ tin cậy 95%);

uRW: Độ lệch chuẩn tái lập (nội bộ) tương đối của PTN hoặc dựa vào độ lặp lại nếu không thực hiện độ tái lập (nội bộ);

ubias: ĐKĐBĐ chuẩn tương đối do độ chệch của kết quả (từ kết quả độ thu hồi); ucref: ĐKĐBĐ của chất chuẩn sử dụng (thường ít ảnh hưởng nên có thể bỏ qua); RMSbias: Trung bình bình phương của các giá trị độ chệch (bias);

2 2 Cref bias u RMS + n bias  2 ) ( 2 2 ) ( ) (uRW + ubias

bias: Độ chệch.

2.2.3. Định lượng một số mẫu viên nang Amoxicillin lưu hành trên thị trường

Tiến hành định lượng 10 mẫu thuốc viên nang Amoxicillin của các hãng sản xuất khác nhau đang lưu hành trên địa bàn tỉnh Quảng Ngãi.

Bảng 2.1: Danh mục mẫu thuốc nghiên cứu

Ký hiệu Tên thuốc Nhà sản xuất Số đăng ký

T1 Hagimox (Amoxicillin 500mg)

Công ty cổ phần Dược

Hậu Giang VD-24602-16

T2 Amoxicillin 500mg Công ty cổ phần dược

phẩm và sinh học y tế VD-24579-16 T3 Amoxicillin 250mg Công ty cổ phần dược phẩm Trung ương Vidipha VD-20471-14 T4 Moxilen (Amoxicillin 500mg) Modochemie Ltd - Factory B (Cyprus) VN-17099-13 T5 Amoxicillin 250mg Công ty cổ phần dược

phẩm Minh dân VD-18307-13

T6 Moxacin (Amoxicillin 500mg)

Công ty cổ phần xuất

nhập khẩu y tế Domesco VD−14845−11 T7 Amoxicillin 500mg Brawn Laboratories

Limited (India) VN-15238-12 T8 Amoxy (Amoxicillin 250mg) Flamingo Pharmaceuticals Ltd. (India) VN-17196-13 T9 Fabamox (Amoxicillin 500mg) Công ty cổ phần dược phẩm Trung ương I VD-25792-16 T10 Amoxicillin 500mg Công ty cổ phần hóa –

dược phẩm Mekophar VD-20020-13

❖ Phương pháp phổ hồng ngoại

Tiến hành định lượng Amoxicillin bằng phương pháp FTIR dựa trên các điều kiện phân tích đã khảo sát.

Hình 2.3: Viên nén dùng để đo phổ hồng ngoại

❖ Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao theo quy trình Dược điển Việt

Nam 5

- Dung dịch đệm pH 5,0: Hòa tan 13,6 g kali dihydrophosphat trong 2000 ml nước, điều chỉnh tới pH 5,0  0,1 với dung dịch kali hydroxyd 45%.

- Pha động: Dung dịch đệm pH 5.0 - acetonitril (96 : 4). Điều chỉnh tỷ lệ acetonitril để đạt điều kiện sắc ký yêu cầu (nếu cần).

- Dung dịch chuẩn: Pha Amoxicillin trihydrat chuẩn trong dung dịch A để có nồng độ Amoxicillin chính xác khoảng 1,0 mg/ml (chỉ dùng trong vịng 6 giờ).

- Dung dịch thử: Cân thuốc trong từng nang của 20 nang, tính khối lượng trung bình, trộn đều, rồi nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột thuốc tương ứng khoảng 0,200 g Amoxicillin, pha trong dung dịch A vừa đủ 200,0 ml, lắc siêu âm để hịa tan và lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 m (chỉ dùng trong vòng 6 giờ).

- Điều kiện sắc ký:

+ Cột Purospher Star Rp18e (250  4 mm, 5 m); + Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 230 nm; + Tốc độ dịng: 1,5 ml/min;

+ Thể tích tiêm: 10 l; + Nhiệt độ cột: 250C. - Cách tiến hành:

Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống: Tiêm dung dịch chuẩn, tính trên peak chính thu được trên sắc ký đồ: hệ số dung lượng phải nằm trong khoảng 1,1 đến 2,8; số đĩa lý thuyết của cột không nhỏ hơn 1700; hệ số đối xứng không lớn hơn 2,5 và độ lệch chuẩn tương đối của các diện tích peak từ 6 lần tiêm lặp lại mẫu chuẩn không lớn hơn 2,0 %.

Tiêm riêng biệt dung dịch thử và dung dịch chuẩn.

Tính hàm lượng Amoxicillin, C16H19N3O5S, trong viên từ diện tích peak trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn và dung dịch thử và hàm lượng C16H19N3O5S trong Amoxicillin trihydrat chuẩn.

❖ So sánh kết quả định lượng Amoxicillin giữa hai phương pháp

Đánh giá kết quả định lượng Amoxicillin bằng cách đánh giá độ lệch chuẩn tương đối giữa hai phương pháp.

2.2.4. Các phương pháp đánh giá kết quả

- Đánh giá kết quả trên cơ sở các yêu cầu của AOAC về xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp.

- Phương pháp kiểm định T-Test (kiểm định sự khác biệt) được sử dụng trong kiểm định sự khác biệt về giá trị trung bình của tổng thể với một giá trị cho trước, hoặc kiểm định sự khác biệt về giá trị trung bình giữa hai tổng thể.

Dựa vào các giá trị tStat và tCritical để đánh giá sự tương đồng giữa 2 kết quả phân tích. [6]

- Phân tích phương sai (Analysis of Variance) hay còn gọi là kiểm định ANOVA là một kỹ thuật thống kê tham số được sử dụng để so sánh các bộ dữ liệu. Nói một cách dễ hiểu, phân tích ANOVA có chức năng đánh giá sự khác biệt tiềm năng trong một biến phụ thuộc mức quy mô bằng một biến mức danh nghĩa có từ 2 loại trở lên. Các nhà phân tích sử dụng thử nghiệm ANOVA để xác định ảnh hưởng của các biến độc lập đối với biến phụ thuộc trong nghiên cứu hồi quy. ANOVA cịn được gọi là phân tích phương sai Fisher.[6]

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát các điều kiện định lượng Amoxicillin

3.1.1. Lựa chọn vùng phổ hồng ngoại để định lượng Amoxicillin

Hình 3.1: Phổ FTIR của Natri croscarmellose

Hình 3.3: Phổ FTIR của Natri laurylsufat

Hình 3.5: Phổ FTIR của viên nang Amoxicillin

So sánh phổ của Amoxicillin và phổ của các tá dược thường được sử dụng trong thành phần của viên nang Amoxicillin.

Vùng phổ 1815 - 1730 cm−1, xuất hiện peak đại diện cho nhóm cacbonyl của Amoxicillin, khơng có sự ảnh hưởng của các tá dược.

Do đó, đây là dải phổ được chọn để phân tích định lượng Amoxicillin.

3.1.2. Khảo sát tỉ lệ khối lượng Amoxicillin/KBr

Tiến hành cân chất chuẩn Amoxicillin một lượng có hàm lượng thay đổi trong khoảng 2 - 20 mg và KBr (đã được sấy đến khối lượng không đổi và nghiền mịn) sao cho hàm lượng tổng gồm mẫu bột và KBr là 200 mg. Các mẫu được trộn đều và đồng nhất trên cối mã não. Chuyển toàn bộ vào bộ dụng cụ ép viên, nén viên trong 10 phút, tiến hành đo phổ IR trong vùng 1815 - 1730 cm-1, độ hấp thụ A được xác định dựa trên chiều cao đỉnh peak. Kết quả được trình bày trong bảng sau:

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát tỷ lệ Amoxicillin/KBr Tỷ lệ Tỷ lệ Lượng cân chuẩn Amoxicilin (mg) Hàm lượng Amoxicilin (mg) Độ hấp thụ 16,84 17,66 9:91 19,31 1,146 10:90 20,25 1,220 7:93 16,48 0,985 8:92 18,48 1,086 5:95 11,49 0,680 6:94 14,21 0,839 10,02 12,39 14,37 16,11 3:97 6,77 0,410 4:96 9,29 0,563 5,90 8,10 1:99 2,33 0,141 2:98 4,64 0,292 2,03 4,05

Từ kết quả ở bảng trên cho thấy, độ hấp thụ A có sự thay đổi giữa các lần đo. Khi tăng tỷ lệ khối lượng Amoxicillin/KBr thì độ hấp thụ quang cũng tăng dần. Nếu độ hấp thụ quang A lớn thì dẫn đến sai số phép đo lớn còn nếu lượng mẫu quá nhỏ thì lượng cân khơng chính xác.

Ta thấy tỷ lệ Amoxicillin/KBr là 3/97 có giá trị độ hấp thụ A = 0.410 phù hợp cho phương pháp phân tích.[1],[19]

3.1.3. Khảo sát khối lượng mẫu dùng để nén viên và độ lặp lại của quá trình nén viên viên

Để thu được viên nén đường kính 13 mm có bề dày phù hợp, tiến hành khảo sát lượng mẫu (Amoxicilin và KBr) đem ép viên từ 150 mg, 200 mg và 250 mg. Nhận thấy rằng, lượng mẫu đem ép viên tăng kéo theo độ hấp thụ tăng. Tuy nhiên, khi cân lượng ép viên là 150 mg, thì viên dễ bị rạn, nứt. Với lượng mẫu đem ép viên lớn (250 mg), bề dày viên lớn, độ lặp lại của độ hấp thụ quang kém (bảng kết quả dưới đây). Vì vậy, lượng mẫu đem ép viên để được viên nén có độ hấp thụ phù hợp là 200 mg.

200mg 250mg 1 0,399 0,568 2 0,408 0,516 3 0,405 0,574 4 0,407 0,522 5 0,396 0,540 6 0,394 0,582 Trung bình 0,402 0,550 RSD (%) 1,48 5,12 Độ hấp thụ TT

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát khối lượng nén viên

Qua các khảo sát trên, ta rút ra các điều kiện để định lượng Amoxicillin: - Tỉ lệ Amoxicillin/KBr: 3/97;

- Lượng mẫu để ép thành viên nén có đường kính 13 mm: 200 mg với thời gian ép viên là 10 phút;

- Vùng phổ định lượng: 1815 – 1730 cm−1;

- Điều kiện phịng thí nghiệm: nhiệt độ 25 ± 10C, độ ẩm 50 – 55%RH.

3.2. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp 3.2.1. Độ tuyến tính 3.2.1. Độ tuyến tính

Chuẩn bị 5 viên chuẩn có hàm lượng Amoxicillin lần lượt: 2, 4, 6, 8, 10 mg/viên. Đo độ hấp thụ vào 3 ngày khác nhau.

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát độ tuyến tính

Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 TB

1 2,03 0,141 0,138 0,139 0,139 2 4,05 0,292 0,285 0,293 0,290 3 5,90 0,410 0,413 0,405 0,409 4 8,10 0,563 0,559 0,563 0,562 5 10,02 0,680 0,681 0,684 0,682 TT Khối lượng Amoxicilin (mg) KẾT QUẢ ĐỘ TUYẾN TÍNH Độ hấp thụ

Đường chuẩn thu được bằng cách lấy trung bình ba đường chuẩn, ta có phương trình hồi quy: y= 0,0677x + 0,0087 (với y là chiều cao độ hấp thụ, x là khối lượng Amoxicillin), hệ số tương quan r2= 0,9992.

y = 0,0677x + 0,0087 R² = 0,9992 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 Hàm lượng Amoxicilin (mg) Độ hấp thụ

Hình 3.6: Đường hồi quy tuyến tính

Giá trị r2 phù hợp với các yêu cầu về giá trị r2 theo hướng dẫn thẩm định đã được chấp nhận của WHO.

Bảng 3.4: Kết quả phân tích phương sai ANOVA đường hồi quy

Regression Statistics Multiple R 0,99959126 R Square 0,99918269 Adjusted R Square0,99891026 Standard Error0,00708569 Observations 5 ANOVA df SS MS F Significance F Regression 1 0,184139 0,1841 3667,6 9,9191E-06 Residual 3 0,000151 5E-05 Total 4 0,18429 Coefficients Standard

Error t Stat P-value Lower 95%

Upper 95% Lower 95,0% Upper 95,0% Intercept 0,00873326 0,007441 1,1736 0,3252 -0,01494867 0,032415 -0,01495 0,032415 X Variable 1 0,06773025 0,001118 60,561 1E-05 0,064171047 0,071289 0,064171 0,071289

Kết quả phân tích phương sai cho thấy: Significance F = 9.919E - 06 < a = 5%

Do đó, phương trình hồi quy phù hợp với thực nghiệm.

3.2.2. Độ chụm

- Chuẩn bị 06 viên mẫu thử, hàm lượng Amoxicillin trong mỗi viên khoảng 6mg. Đồng thời chuẩn bị 2 viên chuẩn Amoxicillin có hàm lượng tương đương trong cùng điều kiện.

- Tiến hành phân tích định lượng và tính kết quả hàm lượng Amoxicillin ta được bảng kết quả sau:

Bảng 3.5: Kết quả độ lặp lại TT TT 1 2 3 4 5 6 97,5 96,3 97,0

Lượng cân ép viên (mg) 6,60 Độ hấp thụ 0,407 0,405 0,405 0,396 0,390 0,397 Trung bình %RSD 6,82 6,87 6,82 6,58 6,49 98,3 98,2 98,3 97,6 0,83 Hàm lượng (%)

Kết quả cho thấy hàm lượng Amoxicillin trong mẫu thử đạt theo yêu cầu về hàm lượng của DĐVN 5 (hàm lượng Amoxicillin từ 90,0 đến 110,0% so với hàm