Quan sát các cây con khoai tây sau 30 ngày gieo hạt, ta thấy sorbitol trong môi trường không chỉ ảnh hưởng đến tỷ lệ nảy mầm của hạt mà còn ảnh hưởng đến thời gian nảy mầm và chiều dài thân mầm. Các cây con trong môi trường có nồng độ sorbitol cao hơn nảy mầm chậm hơn và có thân ngắn hơn (hình 3.2).
3.2. Đánh giá các chỉ số ni cấy mô sau giai đoạn tập chống chịu
Các cây con nảy mầm trên môi trường ĐC (môi trường MS) và môi trường TN (MS có bổ sung lần lượt 50 mM, 100 mM, 200 mM sorbitol) là những cây con đã qua tập chống chịu, được tiến hành cấy chuyển sang mơi trường có độ hạn ngang bằng và cao hơn (theo sơ đồ hình 2.2). Sau 4 - 6 tuần khả năng tập chống chịu của cây con khoai tây sẽ được đánh giá thông qua một số chỉ số: hệ số nhân chồi; chiều cao chồi; số lá; số rễ; trọng lượng tươi; trọng lượng khô; hàm lượng Chl.; hàm lượng proline.
3.2.1. Hệ số nhân chồi
Ở mẫu ĐC, các chồi được cấy chuyển nhưng hồn tồn khơng bị ảnh hưởng của hạn (các mơi trường ni cấy đều khơng chứa sorbitol) có hệ số nhân tương đối đạt 1,95 lần sau 4 tuần và 4,65 sau 6 tuần ni cấy (Hình 3.3). Hệ số nhân chồi chịu ảnh hưởng không nhỏ của hàm lượng sorbitol tăng cao trong môi trường nuôi cấy. Các mẫu chưa qua tập chống chịu khi chuyển sang các môi trường 50, 100 và 200 mM sorbitol, hệ số nhân chồi giảm dần xuống mức 1,75; 1,35 và 1,08 lần sau 4 tuần. Cũng cùng chiều hướng đó, sau 6 tuần, hệ số nhân giảm từ 4,65 trong cơng thức 0-0 xuống cịn 3,66 và 2,67 lần lượt trong các công thức chuyển 0-50 và 0-100. Khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng cao đến 200 mM, hệ số nhân sau 6 tuần của các mẫu chưa qua tập chống chịu chỉ đạt 1,73.
Các mẫu đã qua tập chống chịu cũng không thể hiện khả năng nhân chồi trong nuôi cấy khi được chuyển sang các mơi trường tiếp tục duy trì mức độ hạn nhân tạo hoặc nâng cao mức hạn. Trong các công thức chuyển mẫu đã qua tập chống chịu, chỉ có cơng thức 50-100 cho hệ số nhân cao hơn mẫu chưa qua tập chống chịu trong cùng môi trường là 0-100, đạt 1,35 sau 4 tuần và 2,67 sau 6 tuần cấy chuyển. Ở các môi trường khác 50 và 200 mM sorbitol khơng có mẫu đã qua tập chống chịu nào có hệ số nhân chồi cao hơn so với mẫu chưa qua tập chống chịu.
Hình 3.3: Hệ số nhân chồi của khoai tây HH7 trên mơi trường có các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm
3.2.2. Chiều cao chồi
Hình 3.4. Chiều cao chồi của khoai tây HH7 trên mơi trường có các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm
Trong công thức chuyển môi trường ĐC (0-0), chiều cao chồi trung bình đạt 7,06 cm sau 4 tuần và 8,48 cm sau 6 tuần ni cấy (Hình 3.4). Ở những mẫu chưa qua tập chống chịu, chiều cao chồi trung bình chịu ảnh hưởng lớn bởi hàm lượng sorbitol trong môi trường. Khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng đến 50 mM, sau 4 tuần chiều cao chồi giảm xuống 1,5 lần so với mơi trường khơng có sorbitol. Khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng đến 200 mM, chiều cao chồi chỉ còn 1,96 cm, giảm 3,6 lần so với mơi trường khơng có sorbitol sau 4 tuần. Tuy nhiên ở cơng thức 0-100, chiều cao chồi có giảm so với cơng thức ĐC nhưng lại cao hơn công thức 0-50.
Những mẫu đã qua tập chống chịu trong các môi trường chứa sorbitol không thể hiện rõ sự phát triển về chiều cao chồi. Trong các công thức chuyển môi trường đã qua tập chống chịu chỉ công thức 50-50 cho cây có chiều cao chồi cao gấp 1,1 lần và 1,2 lần so với công thức môi trường đối chứng 0-50 lần lượt sau 4 tuần và 6 tuần. Trong cơng thức 100-200 cũng cho cây có chiều cao chồi cao hơn so với mẫu chưa qua tập chống chịu trong cùng môi trường 200 mM sorbitol. Tuy nhiên sự chênh lệch này không đáng kể. Ở những mẫu đã qua tập chống chịu còn lại đều có chiều cao chồi thấp hơn hoặc tương đương với mơi trường ĐC.
Nhìn chung có thể nhận thấy các cơng thức TN có hệ số nhân tương đối cao thì chiều cao chồi thấp và ngược lại. Điều này thể hiện sinh khối của mẫu in vitro có
những giới hạn nhất định trong điều kiện hạn. Việc đánh giá khối lượng mẫu sẽ cho thông tin quan trọng hơn về sinh trưởng của khoai tây trong điều kiện hạn nhân tạo.
3.2.3. Số lá
Trong mơi trường khơng có sorbitol, số lá trung bình của mẫu đạt giá trị thấp nhất sau cả 4 tuần và 6 tuần (Hình 3.5). Ở các mẫu chưa qua tập chống chịu, sau 4 tuần, khi nồng độ sorbitol trong mơi trường tăng, số lá trung bình tăng 5,44 lá trong môi trường 50 mM sorbitol và 6,75 lá trong môi trường 100 mM sorbitol. Khi nồng độ sorbitol tăng đến 200 mM, số lá trung bình giảm xuống cịn 6,1 lá. Tương tự sau 6 tuần, khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng đến 50 mM và 100 mM thì số lá trung bình đạt đến 4,51 lá và 5,8 lá, lần lượt. Có một sự khác biệt so với 4 tuần là sau 6 tuần, khi nồng độ sorbitol trong mơi trường tăng đến 200 mM thì số lá trung bình lại tăng đến 6,61 lá.
Ở những mẫu đã qua tập chống chịu, trong các công thức 50-50, 100-100, 100-200 và 200-200, cho số lá trung bình lớn hơn so với những mẫu chưa qua tập chống chịu khi được cấy chuyển sang mơi trường có nồng độ sorbitol tương đương hoặc cao hơn cả sau 4 tuần và 6 tuần. Tuy nhiên sự khác biệt này tương đối nhỏ. Trong công thức 50-100 và 50-200, tuy mẫu đã qua tập chống chịu nhưng số lá lại giảm nhẹ so với môi trường ĐC 0-100 và 0-200, tương ứng, sau 4 tuần. Sau 6 tuần thì số lá trung bình của mẫu trong cơng thức 50-200 tăng lên 1,1 lần so với môi trường ĐC 0-200.
So sánh giữa các nhóm mơi trường, có thể thấy rằng hàm lượng sorbitol trong môi trường hạn cấp 2 ảnh hưởng rõ rệt đến số lá theo chiều hướng làm tăng số lá trung bình/chồi. Thực tế thì tổng số lá ở các nhóm mơi trường hạn cao vẫn ít hơn số lá ở mơi trường hạn thấp nhưng do số chồi thì ngược lại, lại thấp hơn nên số lá/chồi mới có xu hướng tăng. Về hình thái lá, các lá trong môi trường hạn cao 200 mM sorbitol rất bé, màu xanh tương đối nhạt hơn lá trong môi trường hạn vừa 50 mM, 100 mM sorbitol hay khơng hạn.
Hình 3.5. Số lá trung bình của khoai tây HH7 trên mơi trường có các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm
3.2.4. Số rễ
Số rễ khoai tây HH7 nuôi cấy chịu ảnh hưởng rõ rệt bởi hàm lượng sorbitol trong môi trường. Số rễ trung bình/chồi của các mẫu chưa qua tập chống chịu khi chuyển sang mơi trường có sorbitol đều giảm thể hiện qua so sánh công thức cấy chuyển 0-0 với các công thức 0-50, 0-100 và 0-200 (Hình 3.6).
Hình 3.6. Số rễ trung bình của khoai tây HH7 trên mơi trường có các nồng độ
sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm
Biểu đồ về số rễ của mẫu chồi nuôi cấy cho thấy có xu hướng tăng khi hàm lượng sorbitol trong môi trường tăng ở những mẫu đã qua tập chống chịu so với những mẫu chưa qua tập chống chịu trong cùng môi trường nuôi cấy. Cụ thể, sau 4 tuần và 6 tuần, cơng thức mơi trường 50-50 có số rễ trung bình cao hơn mơi trường ĐC 0-50, lần lượt gấp 1,5 và 1,2 lần. Tương tự, sau 4 tuần, số rễ trung bình của mẫu trong cơng thức chuyển 50-100 và 100-100 cao gấp 1,1 và 1,3 lần so với công thức môi trường ĐC 0-100. Xu hướng này cũng được ghi nhận trong nhóm mơi trường 200 mM sorbitol trong các công thức 0-200, 50-200, 100-200 và 200-200. Một điều đặc biệt là, những mẫu đã qua tập chống chịu ở ngưỡng 50 mM và 100 mM sorbitol
trong các công thức chuyển môi trường 50-50 và 100-100 có số rễ trung bình cao hơn cả mẫu trong điều kiện môi trường không bị hạn.
3.2.5. Trọng lượng tươi và trọng lượng khơ
Hình 3.7. Trọng lượng tươi và trọng lượng khô của chồi khoai tây HH7 trên mơi trường có các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn
ở giai đoạn nảy mầm (đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy)
Trọng lượng tươi của khoai tây HH7 chịu ảnh hưởng lớn bởi điều kiện hạn. Khi chuyển cây con nảy mầm sau 30 ngày sang các mơi trường có chứa sorbitol, hàm lượng sorbitol càng cao thì trọng lượng tươi của mẫu càng giảm. Trong công thức ĐC 0-0, trọng lượng tươi của mẫu đạt 241,55 mg và giảm mạnh xuống còn 174,99 mg và 147,36 mg khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng lên 50 mM và 100 mM. Khi nồng độ sorbitol trong môi trường tăng cao đến 200 mM, trọng lượng tươi của mẫu chỉ còn 71,79 mg. Điều này rất phù hợp với sinh lý nói chung của cây trồng khi gặp điều kiện môi trường gây bất lợi về áp suất thẩm thấu làm giảm khả năng hấp thu nước của cây [58]. Trong khi đó trọng lượng khơ có giảm khi chuyển cây sang các
điều kiện hạn tăng cao nhưng mức giảm là tương đối ít so với biến động của trọng lượng tươi (Hình 3.7). Cụ thể, trong công thức ĐC 0-0, trọng lượng khô của mẫu đạt 20,99 mg, giảm cịn 18,37 mg và 14,72 mg trong mơi trường 0-100 và 0-200. Tuy nhiên, trong công thức TN 0-50, trọng lượng khơ đạt 22,19 mg, có sự tăng nhẹ so với mơi trường ĐC 0-0. Xem xét về tính tập chống chịu, cả giá trị trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mẫu đều tăng ở các mẫu đã được tiếp xúc hạn so với các mẫu đối chứng trong cùng nhóm mơi trường thí nghiệm. Cụ thể, trong cả 3 nhóm mơi trường, trọng lượng tươi và trọng lượng khô của các mẫu đã tiếp xúc hạn ở ngưỡng 50 mM sorbitol trong giai đoạn nảy mầm đều cao hơn so với mẫu chưa được tập chống chịu. Đặc biệt là mẫu trong cơng thức 50-100 có trọng lượng tươi đạt 185,95 mg, trọng lượng khô đạt 27,48 mg gấp 1,3 lần và gấp 1,5 lần so với mẫu đối chứng công thức 0-100, tương ứng.
Xét đến tỉ lệ giữa trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mỗi loại mẫu trong các cơng thức chuyển mơi trường có thể thấy rõ sự khác biệt lớn thể hiện chủ yếu trong khả năng trữ nước của cây nuôi cấy trong các điều kiện hạn. Ở mơi trường ni cấy bình thường (khơng bổ sung sorbitol) trọng lượng tươi của các mẫu đạt hơn 11,5 lần so với trọng lượng khơ. Trong khi đó, trên mơi trường 50mM sorbitol và 100mM sorbitol, tỉ lệ giữa trọng lượng tươi và khô của chồi khoai tây ở các công thức chuyển đều xấp xỉ nhau và vào khoảng từ thấp nhất 6,77 đến cao nhất 7,88 lần. Đối với mơi trường có độ hạn cao, 200mM sorbitol, tỉ lệ này thấp hơn hẳn, chỉ đạt 4,88 ở công thức 0-200 và tăng dần đến 5,66 là mức cao nhất ở công thức 200-200. Điều này cho thấy điều kiện hạn trong nuôi cấy đã làm giảm nhanh khả năng hấp thu nước của khoai tây in vitro nhưng không làm giảm khả năng tích lũy chất khơ. Và, nếu các
chồi khoai tây đã qua giai đoạn tập chống chịu khi nảy mầm thì khả năng tích lũy chất khơ của chúng được cải thiện đáng kể.
3.3. Hàm lƣợng chlorophyll ở khoai tây HH7 đã qua giai đoạn tập chống chịu
Hình 3.8. Hàm lượng chlorophyll trong lá khoai tây HH7 trên mơi trường có các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm
(đánh giá sau 6 tuần ni cấy)
Chl. là nhóm sắc tố chiếm vai trị quan trọng nhất đối với quang hợp. Trong đó, chỉ có Chla chuyển đổi năng lượng ánh sáng mặt trời thành năng lượng hóa học và Chlb là sắc tố phụ quang hợp quan trọng nhất [4].
Rất nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của hạn đến sự thay đổi trong sinh tổng hợp các sắc tố quang hợp ở thực vật đã được tiến hành và đều cho thấy sự suy giảm về hàm lượng chlorophyll. Manivannan và cs. ghi nhận sự giảm đáng kể hàm lượng Chla, Chlb và Chl tổng số ở cả 5 giống hoa hướng dương (Helianthus annuus L.) khi lượng nước tưới giảm đi 40% [48]. Nghiên cứu về ảnh hưởng của hạn được gây ra bởi sorbitol ở ngô đã chỉ ra sự sụt giảm về hàm lượng của cả Chla và Chlb nhưng tỷ lệ hàm lượng Chla / Chlb lại tăng [36]. Nghiên cứu ảnh hưởng bởi hạn đến hàm lượng chlorophyll ở ba cây trồng họ đậu của Mafakheri và cs năm 2010 đã chỉ ra rằng, hạn làm giảm đáng kể hàm lượng Chla, Chlb và tổng lượng Chl. của cây đậu (Cicer
cứu này, tác giả đã chỉ ra rằng, Chla nhạy cảm với yếu tố hạn hơn so với Chlb. Điều này được minh chứng bởi sự tăng lên về tỷ lệ Chla / Chlb ở mẫu TN so với mẫu ĐC [47].
Trong nghiên cứu này, các cây con được chuyển từ môi trường tập chống chịu sang các mơi trường có hàm lượng sorbitol duy trì và tăng cường (Hình 2.2). Trước hết đối với các mẫu chưa được tiếp xúc hạn trong giai đoạn nảy mầm, hàm lượng Chla và Chlb đều có chiều hướng tăng nhẹ khi được chuyển sang các mơi trường có bổ sung sorbitol (Hình 3.8). Tuy vậy, về tỷ lệ Chla /Chlb khơng thấy có sự ảnh hưởng rõ rệt nào của hàm lượng sorbitol tăng lên trong mơi trường thí nghiệm.
Các cây khoai tây HH7 đã nảy mầm trên môi trường hạn đều có hàm lượng cả Chla và Chlb cao hơn so với các mẫu cây được chuyển từ mơi trường khơng hạn. Trong đó, dễ dàng nhận thấy trên hình 3.8, trong cả 3 nhóm mơi trường, các mẫu khoai tây được tập chống chịu ngưỡng 50 mM sorbitol cho kết quả hàm lượng Chl. tăng cao nhất ở mỗi nhóm mơi trường. Đặc biệt các cơng thức chuyển 50-50 và 50- 100 cho thấy sự tăng tỷ lệ Chla / Chlb đáng kể. Hàm lượng 2 loại Chl. đạt cao nhất ở mẫu chồi chuyển từ môi trường tập chống chịu 50 mM sang môi trường 100 mM sorbitol. Tuy nhiên, mẫu chuyển từ môi trường nảy mầm chứa 100 mM sorbitol sang mơi trường vẫn bổ sung 100 mM sorbitol lại có hàm lượng Chl. giảm thấp gần bằng mức của mẫu chưa qua tập chống chịu. Tương tự ở nhóm 3, các mẫu tập chống chịu 50 mM, 100 mM tăng hàm lượng Chl. trong khi mẫu đã tiếp xúc 200mM lại có chiều hướng giữ hàm lượng Chl. tương đương mẫu chưa qua tập chống chịu (Hình 3.8).
Kết quả nghiên cứu cho thấy, những mẫu đã qua tập chống chịu đều có hàm lượng Chl. cao hơn so với những mẫu chưa qua tập chống chịu và cao hơn so với môi trường đối chứng 0-0. Đặc biệt trong môi trường tiếp xúc hạn ở ngưỡng 50 mM sorbitol cho thấy sự tăng về cả hàm lượng Chla, Chlb và tăng cả về tỷ lệ hàm lượng Chla/ Chlb.
3.4. Hàm lƣợng proline
Proline được coi là chất bảo vệ thẩm thấu, có tác dụng bảo vệ các cấu trúc nội bào và các đại phân tử khi tế bào gặp các điều kiện bất lợi về áp suất thẩm thấu [80]. Do vậy, khi cây gặp điều kiện bất lợi về hạn, thì tế bào sẽ tăng cường sinh tổng hợp
proline để điều chỉnh áp suất thẩm thấu giúp cây tập thích nghi với điều kiện này. Proline có thể được xem là một chất chỉ thị cho việc đáp ứng với các điều kiện bất lợi như hạn hán, độ mặn cao và cả nhiệt độ thấp.
Nghiên cứu về ảnh hưởng của sorbitol đến sự thay đổi hàm lượng proline ở lá ngô do Jain và cs công bố năm 2010 đã chỉ ra rằng sau 24h xử lý với sorbitol, khi hàm lượng sorbitol trong mơi trường tăng thì hàm lượng proline cũng tăng [36].