Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng proline mẫu
Hàm lượng proline của mẫu được xác định bằng phương pháp so màu (Bates và cs., 1973) [6]. Quy trình được tiến hành theo các bước sau:
- Cân 50 mg lá và thân vào ống eppi, cho vào mỗi ống 1 viên bi nghiền - Nghiền với nito lỏng bằng máy nghiền
- Bổ sung 1,5 ml acid sulfosalicylic 3% (w/v), lắc đều ống lên xuống - Ly tâm 7000 vịng/20 phút
- Thu 300 µl dịch nổi, bổ sung 600 µl axit sulfosalicylic 3% (w/v) (Tỷ lệ 1:2) - Thực hiện phản ứng màu: lấy 200µl dịch trong cho vào ống eppi, bổ sung 200 µl axit axetic và 200 µl dung dịch nynhidrin (0,1 g ninhydrin + 2,4 ml acetic acid + 1,6 nml phosphoric acid 6M), ủ phản ứng ở 100oC trong 1 giờ, sau đó dừng phản ứng bằng cách làm lạnh trong đá bào ít nhất 15 phút.
- Bổ sung 400 µl toluence vào hỗn hợp phản ứng, lắc đều - Thu 200 µl dịch nổi
- Bổ sung 800 µl toluence
- Đo độ hấp thụ với bước sóng 520 nm (A520)
Hàm lượng proline trong mẫu được tính tốn bằng cách so sánh với đường chuẩn.
- Pha proline chuẩn trong axit sulfosalicylic 3% (w/v) với các nồng độ: 0 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM, 100 mM, 125 mM và 150 mM.
- Thực hiện phản ứng màu và tiến hành các bước sau đó tương tự như phương pháp xác định proline mẫu.
Bảng 2.3. Nồng độ proline và giá trị độ hấp thụ ở bước sóng 520 nm
Nồng độ proline (mM) A520 0 0,000 25 0,191 50 0,379 75 0,631 100 0,761
- Xây dựng đường chuẩn biểu diễn tương quan giữa nồng độ proline chuẩn và giá trị độ hấp thụ bằng phần mềm Excel 2007 (Hình 2.3).
Hình 2.3. Đường chuẩn proline
- Mối tương quan giữa nồng độ proline chuẩn và giá trị độ hấp thụ được thể hiện bằng công thức:
Y= 0,007x – 0,001 Trong đó:
x là nồng độ proline
y là độ hấp thụ ở bước sóng 520 nm (A520) Vậy công thức xác định nồng độ proline là:
x = (A520 + 0,001) / 0,007 (mM)
Nồng độ proline mM được quy ra hàm lượng µg/mg theo cơng thức: Hàm lượng proline (µg/mg) =
Trong đó:
x: nồng độ proline (mM)
V: thể tích dịch chiết proline (ml)
HSPL: hệ số pha loãng m: khối lượng mẫu tươi (mg)
2.2.5. Xác định biểu hiện của một số gen mã hóa cho yếu tố phiên mã ở khoai tây
(Solanum tuberosum L.) tương đồng với các gen liên quan đến khả năng tập chống chịu ở Arabidopsis thaliana
Kết quả đánh giá khả năng tập chống chịu thông qua các chỉ số nuôi cấy mô, hàm lượng Chl. và proline cho biết nồng độ sorbitol trong môi trường là 50 mM mang lại hiệu quả tập chống chịu hạn cao nhất cho khoai tây HH7. Tiến hành xác định biểu hiện của một số gen mã hóa yếu tố phiên mã trong cây con khoai tây thu được từ mơi trường MS có bổ sung 50 mM sorbitol (mẫu TN) và mơi trường khơng có sorbitol ( mẫu ĐC).
Quy trình xác định biểu hiện một số gen mã hóa yếu tố phiên mã được tiến hành theo sơ đồ hình 2.4.
Thu mẫu Chọn gen đích
Tách RNA tổng số Thiết kế mồi
Kiểm tra, xác định hàm lượng RNA tổng số Xử lý DNA
Tổng hợp cDNA Kiểm tra chất lượng cDNA
Xác định biểu hiện của các gen đích Xử lý số liệu
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình xác định biểu hiện một số gen yếu tố phiên mã