1.4.1. Định nghĩa sắc ký
* Định nghĩa của Mikhai S. Tsvett (1906): Sắc ký là một phƣơng pháp trong
đó các cấu tử của một hỗn hợp đƣợc tách trên một cột hấp thụ đặt trong một hệ thống đang chảy.
* Định nghĩa của IUPAC (1993): Sắc ký là một phƣơng pháp tách trong đó các cấu tử cần tách đƣợc phân bố giữa hai pha, một trong hai pha là pha tĩnh đứng yên còn pha kia chuyển động theo một hƣớng xác định.
1.4.2. Quá trình sắc ký
Sắc ký là một kỹ thuật tách trong đó các cấu tử cần tách trong một hỗn hợp đƣợc vận chuyển bởi pha động đi qua pha tĩnh. Mẫu đi vào pha động đƣợc mang theo dọc hệ thống sắc ký (cột, bản ph ng) có chứa pha tĩnh phân bố đều khắp.
Pha động có thể là chất lỏng hoặc chất khí, pha tĩnh có thể là một lớp phim đƣợc phủ trên bề mặt của chất mang trơ hoặc một bề mặt chất rắn. Sự tƣơng tác xảy ra giữa các cấu tử với pha tĩnh nhờ đó các cấu tử sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh. Do ái lực khác nhau của các chất tan trên pha tĩnh làm chúng di chuyển với những vận tốc khác nhau trong pha động của hệ thống sắc ký, kết quả là chúng đƣợc tách thành những dải trong pha động và vào lúc cuối của quá trình các cấu tử tách hiện ra theo trật tự tăng tƣơng tác với pha tĩnh. Cấu tử di chuyển chậm (tƣơng
tác yếu) ra trƣớc, cấu tử bị lƣu giữ mạnh hơn ra sau dƣới dạng đỉnh (pic ) riêng rẽ (hoặc bậc thang) tùy thuộc vào cách tiến hành sắc ký và đƣợc ghi ra giấy đƣợc gọi là sắc ký đồ.
1.4.3. Các phƣơng pháp tiến hành tách sắc ký
Để thực hiện tách sắc ký có thể sử dụng một trong ba phƣơng pháp sau
* Phương pháp rửa giải: Là kĩ thuật đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong các
phƣơng pháp sắc ký hiện nay. Một lƣợng nhỏ hỗn hợp mẫu đƣợc giới thiệu vào cột với pha động có ái lực với pha tĩnh bé hơn so với bất kỳ cấu tử cần tách có trong mẫu. Vì thế các cấu tử cần tách di chuyển với tốc độ chậm hơn so với chất rửa giải.
* Phƣơng pháp tiền lƣu: Phƣơng pháp tiền lƣu ít đƣợc dùng do khơng thực hiện đƣợc việc tách hoàn toàn các cấu tử, nhất là khi sử dụng việc tách vào mục đích phân tích.
* Phƣơng pháp thế đẩy: Trong phƣơng pháp này, mẫu sau khi đƣa vào cột, ta cho qua cột một dung mơi có ái lực với pha tĩnh mạnh hơn bất kì một cấu tử nào của hỗn hợp tách để đẩy các cấu tử cần tách thoát ra khỏi cột. Cấu tử thoát ra khỏi cột đầu tiên là cấu tử tƣơng tác yếu nhất với pha tĩnh, sau đó đến các cấu tử có ái lực với pha tĩnh tăng dần. Nói chung phƣơng pháp này tạo nên các dải rửa giải khơng hồn tồn đƣợc tách khỏi nhau: có giải thu đƣợc chất nguyên chất nhƣng có dải giữa các dải nguyên chất gồm hỗn hợp giữa chúng.
1.4.4. Các phƣơng pháp sắc kí
1.4.4.1. Sắc ký khí (Gas Chromatagraphy – GC)
Sắc ký khí là một trong những phƣơng pháp quan trọng nhất hiện nay dùng để tách, định lƣợng, xác định cấu trúc các chất, đặc biệt có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu các hợp chất hữu cơ.
Cơ sở để tách bằng sắc ký khí là sự phân bố của mẫu thử giữa hai pha: pha tĩnh có bề mặt tiếp xúc lớn, pha động là khí thấm qua tồn bề mặt tĩnh đó.
Pha động trong GC là chất khí nên chất phân tích cũng phải đƣợc hố hơi để đƣa vào cột sắc ký, thƣờng hố hơi dƣới 250o
Pha tĩnh có thể là chất rắn đƣợc nhồi vào cột hay 1 màng film mỏng bám lên trên bề mặt chất mang trơ, hoặc có thể tạo thành một màng mỏng bám lên mặt trong của thành cột (cột mao quản). Cơ sở cho sự tách ở đây chính là sự phân bố của mẫu trong và ngoài lớp phim mỏng này.
1.4.4.2. Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry - MS)
Nguyên tắc của phƣơng pháp khối phổ là dựa vào chất nghiên cứu đƣợc ion hoá trong pha khí hoặc pha ngƣng tụ dƣới chân không bằng những phƣơng pháp thích hợp thành những ion (ion phân tử, ion mảnh…) có số khối khác nhau, sau đó những ion này đƣợc phân tách thành những dãy ion theo cùng số khối m (chính xác là theo cùng tỷ số khối trên điện tích ion, m/e) và xác suất có mặt của mỗi dãy ion có cùng tỉ số m/e đƣợc ghi lại trên đồ thị có trục tung là xác suất có mặt (hay cƣờng độ), trục hoành là tỉ số m/e gọi là khối phổ đồ. Phổ khối lƣợng đƣợc ghi lại dƣới dạng phổ vạch hay bảng, trong đó cƣờng độ các vạch đƣợc đo bằng phần trăm so với đỉnh có cƣờng độ cao nhất. Đỉnh ion phân tử thƣờng là đỉnh cao nhất.
1.4.4.3. Phương pháp sắc kí khí- khối phổ GC-MS
Phƣơng pháp sắc kí khí – khối phổ (GC-MS) dựa trên cơ sở nối ghép máy sắc kí khí với máy phổ khối lƣợng. Việc phân tách các hợp phần từ một hỗn hợp các hợp chất hữu cơ vốn là sở trƣờng của phƣơng pháp sắc kí khí. Phƣơng pháp phổ khối lƣợng với độ nhạy tuyệt vời (cỡ 10-6
– 10-9g) và tốc độ ghi nhanh sẽ cho những thông tin xác định cấu trúc từ những lƣợng chất rất nhỏ tách ra đƣợc nhờ phƣơng pháp sắc kí. Nhờ có sự liên kết này ngƣời ta có thể thu đƣợc phổ khối lƣợng đủ chấp nhận đối với các hợp phần mà sắc kí khí tách ra đƣợc, kể cả những hợp phần có khối lƣợng chỉ cỡ picogam và có mặt trong vài giây. Giữa máy sắc kí khí và máy khối phổ có một bộ phận dùng để tách khí mang trƣớc khi vào buồng ion hóa. Tồn bộ hệ thống GC-MS đƣợc nối với máy tính để tự động điều khiển hoạt động của hệ, lƣu trữ và xử lí số liệu.
CHƯƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học
Nguyên liệu để nghiên cứu là cây Ngải cứu đƣợc thu hái vào cuối tháng 3 đầu tháng 4 năm 2011 tại huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam. Cây Ngải cứu còn đƣợc gọi là Ngải Diệp, Bắc ngải, Nhả ngải, Quá sú, Ngỏi, Cỏ linh chi. Có tên khoa học là Artemisia vulgris L.., thuộc họ Cúc Asteraceae [5].
Hình 2.1. Lá ngải cứu tươi
2.1.2. Xử lý mẫu[6], [12]
- Mẫu lá ngải cứu thu hái về từ huyện Đại Lộc tỉnh Quảng Nam vào tháng 3 năm 2011.
- Lá ngải cứu rửa sạch bằng nƣớc cất nhiều lần. Chia làm 2 loại: - Loại tƣơi: Để tƣơi bảo quản trong tủ lạnh.
- Loại khô: Đem phơi khô tự nhiên khoảng 3 nắng, sấy đến 800C trong 3 giờ, xay thành bột, bảo quản trong bình hút ẩm để nghiên cứu.
2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.2.1. Hóa chất 2.2.1. Hóa chất
Để thực hiện đề tài này, chúng tơi sử dụng một số hóa chất sau:
- Hóa chất hữu cơ: n-hexane, chloroform, methanol, etyl axetat, etanol, butanol, các loại này ở dạng tinh khiết phân tích (PA).
- Hố chất vơ cơ: NaCl, Na2SO4, nƣớc cất.
2.2.2. Thiết bị thí nghiệm
- Bộ chƣng lôi cuốn hơi nƣớc, máy đo quang UV-VIS, thiết bị cơ quay chân khơng (phịng thí nghiệm khoa Hố, trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Đà Nẵng).
- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS100 Perkin Elmer (Trung tâm kỹ thuật đo lƣờng chất lƣợng II, số 2, Ngô Quyền, Đà Nẵng),
- Máy đo sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) Perkin Elmer (Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm Tp. Hồ Chí Minh, số 2, Nguyễn Văn Thủ, phƣờng Đa Kao, quận 1, Tp. Hồ Chí Minh).
- Tủ sấy, lị nung, cân phân tích, cốc thủy tinh, bình tam giác, ống nghiệm, bếp điện, bếp cách thủy, cốc sứ, các loại pipet, bình định mức, bình hút ẩm, giấy lọc....
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Lấy mẫu và xử lý mẫu [12] 2.3.1. Lấy mẫu và xử lý mẫu [12]
+ Phần tƣơi: chia làm 2 loại là lá ngải cứu già và lá ngải cứu non. Dùng để xác định độ ẩm, hàm lƣợng tro, hàm lƣợng kim loại, chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc.
2.3.2. Xác định độ ẩm, hàm lƣợng tro, hàm lƣợng kim loại [3], [18]
Để xác định độ ẩm, hàm lƣợng tro của lá ngải cứu, sử dụng phƣơng pháp trọng lƣợng và tro hóa mẫu.
2.3.2.1. Xác định độ ẩm của nguyên liệu
- Nguyên tắc: Sấy nguyên liệu ẩm ở 1000C đến khối lƣợng không đổi.
- Cơ sở của phƣơng pháp: Nguyên liệu ẩm có thể xem nhƣ hỗn hợp cơ học gồm chất khô tuyệt đối và nƣớc tự do: m = mo + w.
Trong đó, m: khối lƣợng chung của nguyên liệu.
mo: khối lƣợng của chất khơ tuyệt đối (khơng có ẩm). w: khối lƣợng nƣớc chứa trong nguyên liệu.
Độ ẩm tƣơng đối () của nguyên liệu ẩm: là tỷ số giữa khối lƣợng nƣớc trên
khối lƣợng chung (m) của nguyên liệu ẩm, tính bằng phần trăm:
100 . 100 . w m w m w o
- Cách tiến hành: Để xác định độ ẩm của lá ngải cứu, chúng tôi tiến hành nhƣ sau:
Chuẩn bị sẵn 10 đĩa pectri, đánh dấu và sấy trong tủ sấy đến t0
C > 1000C. Sau khi sấy xong, đặt các đĩa vào bình hút ẩm, để nguội ở nhiệt độ phịng, cân các đĩa ta đƣợc khối lƣợng m1.
Cho vào 5 đĩa pectri: mỗi đĩa m( g) bột lá ngải cứu non. Cho 5 đĩa pectri khác: mỗi đĩa m (g) bột lá ngải cứu già.
Sau đó, tiến hành sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 1000C, cứ sau 5 giờ lại lấy ra cân, cứ nhƣ vậy đến khi khối lƣợng m2 của mẫu và đĩa khơng đổi thì cho vào bình hút ẩm để làm nguội.
Độ ẩm của mỗi mẫu đƣợc tính theo cơng thức trên với w = m + m1 - m2 Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 5 mẫu.
(%) = 5 (%) 5 1
2.3.2.2. Xác định hàm lượng tro của nguyên liệu
- Ngun tắc: Tro hố hồn tồn mẫu ở nhiệt độ 500oC khoảng 8 giờ.
- Tiến hành: Từ 5 mẫu lá ngải cứu non, 5 mẫu lá ngải cứu già vừa đƣợc xác định độ ẩm ở thí nghiệm trên, đem đi tro hố ở 5000C trong 8 giờ cho đến khi tro có màu trắng. Lấy mẫu ra làm nguội mẫu trong bình hút ẩm và cân lại mẫu để xác định hàm lƣợng tro.
Hàm lƣợng tro là hàm lƣợng các oxit hoặc muối của kim loại sau khi các thành phần hữu cơ trong mẫu bị phân hủy và bay hơi hết.
T (%) = 4100% m m T trung bình (%) = 5 T % 5 1
Trong đó m4: Khối lƣợng tro sau khi nung m: Khối lƣợng lá ngải cứu
2.3.2.3. Xác định hàm lượng kim loại
Dùng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử để xác định hàm lƣợng các kim loại nặng: Pb, Cu, As, Hg trong lá ngải cứu.
- Nguyên tắc của phép đo AAS: Cơ sở lý thuyết của phép đo là sự hấp thụ năng lƣợng (bức xạ đơn sắc) của nguyên tử tự do ở trạng thái hơi khi chiếu chùm tia bức xạ qua đám hơi của nguyên tố ấy trong môi trƣờng hấp thụ.
- Tiến hành:
+ Đối với kim loại Hg: Mẫu đƣợc vơ cơ hóa theo phƣơng pháp phá ƣớt hệ kín (lị vi sóng), hóa chất đƣợc sử dụng là HNO3 và H2O2, đo trên máy AAS chế độ
+ Đối với kim loại Pb, Cu, As: Mẫu đƣợc vơ cơ hóa bằng phƣơng pháp khơ
(nung, hịa tan bằng HCl, HNO3) hoặc phá ƣớt, đo trên máy AAS chế độ ngọn lửa (Pb, Cu, As) hoặc chế độ lò graphit (Pb)
2.3.3. Nghiên cứu chiết tách một số hợp chất hóa học trong tinh dầu lá ngải cứu [8], [9] [8], [9]
2.3.3.1. Chiết tách tinh dầu [13], [15]
Tinh dầu đƣợc chiết tách bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc.
- Nguyên liệu: Lá ngải cứu non và lá ngải cứu già đƣợc xay nhỏ, nƣớc cất. -Cách tiến hành: Cân 1 lƣợng lá ngải cứu non, lá ngải cứu già riêng biệt, ngâm trong dung dịch muối NaCl trong vài giờ, sau đó cho vào bình cầu chƣng cất, thêm nƣớc cất bình cầu. Lắp dụng cụ, tiến hành đun đến khi lƣợng tinh dầu tăng lên khơng đáng kể nữa thì kết thúc quá trình chƣng cất.
Sau đây là nội dung của quá trình chiết tinh dầu lá ngải cứu – Hình 2.4
Hình 2.4. Sơ đồ chiết tách tinh dầu lá ngải cứu
Lá
Lá ngngảiải ccứuứu nonnon, , lá lá nnggảiải ccứuứu giàgià X
Xử ử llí í
C
Chhiiếtết bbằằnngg pphhươươnngg pphháápp
c
chhưnưngg ccấtất llôiôi ccuuốnốn hhơơii nnướướcc
T
Tiinnhh ddầầuu LàLàmm kkhhaann bbằnằngg
N
Naa22SSOO44
Khảo sát các y
Khảo sát các yếu tố ảnh ếu tố ảnh
hƣởng đến quá trình hƣởng đến quá trình chƣng cất chƣng cất X Xáácc địđịnnhh tthhàànnhh pphhầnần,, c
côônngg tthhứứcc ccấấuu ttạạoo ccủủaa
c cáácc hhợpợp cchhấtất Đ Đoo GGCC--MMSS X Xáácc đđịịnnhh đđộộ ẩẩmm X Xáácc địđịnnhh hhààmm llượượnngg t trro o X Xáácc đđịịnnhh hhààmm llưượợnngg kkiimm l looạạii
2.3.3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến lượng tinh dầu[15],[16]
Có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến lƣợng tinh dầu thu đƣợc nhƣ tỉ lệ khối lƣợng lá tƣơi/nƣớc, thời gian chƣng cất, nồng độ muối NaCl, độ ẩm lá. Do đó chúng tơi chọn khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng sau:
* Khảo sát nồng độ NaCl:
Tiến hành ngâm 100 g nguyên liệu trong dung dịch NaCl nồng độ 0%, 5%, 10%, 12% và 15% trong 1 giờ. Sau đó chƣng cất trong 5 giờ. Đọc thể tích tinh dầu thu đƣợc, từ đó lựa chọn nồng độ NaCl thích hợp nhất.
* Khảo sát ngun liệu khơng xay và nguyên liệu xay: - Nguyên liệu không xay:
Tiến hành chƣng cất 100g nguyên liệu (lá ngải cứu non, lá ngải cứu già) khơng xay với thể tích nƣớc là 300 ml cho đến khi thể tích tinh dầu thu đƣợc khơng thay đổi. Đọc thể tích tinh dầu thu đƣợc.
- Nguyên liệu xay nhỏ:
Tiến hành chƣng cất 100g nguyên liệu (ngải cứu non, lá ngải cứu già) đã xay nhỏ thành sợi nhỏ khoảng 3mm bằng máy xay sinh tố trong 3 phút với thể tích nƣớc là 300 ml cho đến khi thể tích tinh dầu thu đƣợc khơng đổi. Đọc thể tích tinh dầu thu đƣợc, so sánh với trƣờng hợp chƣng cất nguyên liệu không xay, từ đó lựa chọn kích thƣớc ngun liệu phù hợp để hiệu suất tinh dầu thu đƣợc là lớn nhất.
* Khảo sát tỉ lệ khối lƣợng lá tƣơi/nƣớc:
Khi gia nhiệt hỗn hợp nguyên liệu và nƣớc, hơi nƣớc thẩm thấu vào trong các lớp tế bào, làm phá vỡ túi tinh dầu và tinh dầu bị lôi cuốn theo hơi nƣớc. Tỷ lệ khối lƣợng nguyên liệu / thể tích nƣớc nhỏ hơn hay lớn hơn lƣợng nƣớc thích hợp đều làm giảm lƣợng tinh dầu. Lƣợng nƣớc quá nhiều sẽ làm cho 1 số thành phần tinh dầu có tính phân cực sẽ tan vào nƣớc, lƣợng nƣớc q ít thì khơng đủ hịa tan các chất keo, muối bao bọc xung quanh túi tinh dầu.
Tiến hành khảo sát với 100g nguyên liệu (lá ngải cứu non, lá ngải cứu già) xay nhỏ, với thể tích nƣớc lần lƣợt là 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 400 ml, đun trong 5 giờ bằng phƣơng pháp chƣng cất lơi cuốn hơi nƣớc. Đọc thể tích tinh dầu
thu đƣợc sau khi kết thúc quá trình chƣng cất, so sánh và lựa chọn tỉ lệ khối lƣợng lá tƣơi / thể tích nƣớc để thu đƣợc hiệu suất cao nhất.
* Khảo sát thời gian chƣng cất:
Tiến hành chƣng cất 100g nguyên liệu (lá ngải cứu non, lá ngải cứu già) với thể tích nƣớc là 300 ml trong thời gian từ 2, 3, 4, 5, 6, 7 giờ. Đọc thể tích tinh dầu thu đƣợc, tính hiệu suất, từ đó lựa chọn thời gian thích hợp nhất cho q trình chƣng