3.2.1.Khảo sát các điều kiện tối ưu của phép phân tích3.2.1.1.Quy trình khảo sát 3.2.1.1.Quy trình khảo sát
Tiến hành định lượng trong điều kiện tránh ánh sáng. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 10mg riboflavin, thêm hỗn hợp gồm 5ml axit axetic 2,5% và 100ml nước. Đun cách thủy 1 giờ, lắc liên tục. Thêm 500ml nước, để nguội, thêm 30ml dung dịch natri hidroxyd 1N để điều chỉnh môi trường pH = 6 - 7( chỉ thị là quỳ tím) và lắc liên tục, pha loãng với nước thành 1000,0ml, lắc đều. Lọc loại bỏ dung dịch đầu. Điều chỉnh máy đo quang phổ với độ nhạy thích hợp. Đo độ hấp thụ của dung dịch lọc ở bước sóng 444nm, so với mẫu trắng là nước. Tính hàm lượng riboflavin trong mẫu theo đường chuẩn, đo mẫu thử trong cùng điều kiện với dãy chuẩn.
3.2.1.2 Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại
Bước sóng hấp thụ cực đại là tại đó giá trị mật độ quang là lớn nhất. • Chuẩn bị dung dịch tiêu chuẩn : Dùng pipet lấy chính xác Vml dung
dịch chuẩn vitamin B2 có nồng độ 0,5µg/ml vào bình định mức 50ml, thêm dung dịch NaOH 1N để điều chỉnh môi trường pH=6-7. Thêm lắc đều rồi định mức đến vạch.
• Tìm bước sóng hấp thụ cực đại : Cho dung dịch tiêu chuẩn pha ở trên vào cuvet rồi tiến hành đo mật độ quang của dung dịch tại các bước sóng khác nhau từ thấp đến cao ( từ 380nm đến 600nm), mỗi giá trị cách nhau 10nm. Vẽ đồ thị từ các số liệu đo được, ta xác định được 4
bước sóng hấp thụ cực đại là : 265nm, 267nm, 375nm và 444nm. Chọn bước sóng hấp thụ cực đại là 444nm.
3.2.1.3. Khảo sát khoảng thời gian tối ưu
Thời gian tối ưu được xác định đối với phức, là khoảng thời gian mà mật độ quang đạt giá trị lớn nhất và ổn định.
Các bước tiến hành thí nghiệm như quy trình trên. Sau đó khảo sát giá trị mật độ quang của dung dịch trong khoảng thời gian khác nhau : 1 phút, 3 phút, 5 phút, 10 phút..., ở bước sóng đã khảo sát là 444nm. Tại khoảng giá trị nào mà dung dịch đạt giá trị mật độ quang lớn nhất và ổn định nhất chính là khoảng thời gian tối ưu.
3.2.1.4. Khảo sát pH tối ưu
Vì quang phổ hấp thụ tia tím tử ngoại của vitamin B2 phụ thuộc đáng
kể vào pH nên ta cần khảo sát giá trị pH tối ưu của phép phân tích.
Các bước tiến hành thí nghiệm như quy trình trên. Sau đó ta thay đổi các giá trị pH của dung dịch màu bằng cách thêm axit hoặc bazo. Rồi tiến hành đo giá trị mật độ quang của dung dịch màu. Tại giá trị pH nào mà giá trị mật độ quang lớn nhất thì chính là giá trị pH tối ưu. Theo tham khảo tài liệu thì pH tối ưu là 6-7.
3.2.1.5. Khảo sát giới hạn phát hiện vitamin B2 của phép phân tích
Giới hạn phát hiện là nồng độ nhỏ nhất của vitamin B2. Mục đích của thí nghiệm là kiểm tra đánh giá độ nhạy của phép đo trong các điều kiện đã khảo sát.
hạn dưới của đường chuẩn). Tiến hành đo mật độ quang của dung dịch hấp thụ ta xác định được giới hạn phát hiện của phép phân tích.
3.2.1.6. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính
Vì mật độ quang và nồng độ chỉ tuyến tính trong một khoảng nồng độ dung dịch xác định, nên ta phải tiến hành khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B2 để đảm bảo kết quả phân tích được chính xác.
Các bước tiến hành thí nghiệm như quy trình với các điều kiện tối ưu đã xác định ở trên. Chuẩn bị các mẫu có nồng độ tăng dần ( bắt đầu từ giới hạn phát hiện của phép phân tích). Tiến hành đo mật độ quang của dung dich hấp thụ, ta xác định được khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B2.
3.2.1.7.Xây dựng đường chuẩn và xác định hàm lượng Vitamin B2
Sau khi đã khảo sát tìm được khoảng nồng độ tuyến tính của vitamin B2 ta tiến hành lập đường chuẩn.
•Các bước tiến hành thí nghiệm như quy trình với các điều kiện tối ưu đã xác định ở trên. Ta xây dựng A = f(C) dạng phương trình đường thẳng A = aC + b. Đo mật độ quang sau khi phản ứng kết thúc của 6 mẫu chuẩn dung dịch vitamin B2, với nồng độ tăng dần theo bảng sau :
Nồng độ (µg/ml) 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 Vvitaminb2 (ml) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
• Pha dung dịch mẫu trắng : pha dung dịch mẫu trắng với lượng dung dịch NaOH 1N thêm vào giống hệt như mẫu chuẩn, chỉ khác là khơng có hàm lượng vitamin B2.
• Đo mật độ quang của dãy dung dịch tiêu chuẩn ở bước sóng đã khảo sát 444nm, rồi ghi kết quả vào bảng. Từ đó vẽ đồ thị sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ A = f(C).
• Đo mật độ quang của dung dịch vitamin B2 mẫu, rồi tìm Cx trên đồ thị hoặc dựa vào phương trình : A = aC + b
Hình 1: Đồ thị A = f(C)
3.2.1.8. Điều kiện tiến hành
10mg vitamin B2 Đun cách thủy 1h Để nguội Lắc đều Pha loãng 1000ml Lọc
- Trong tất cả các giai đoạn định lượng cần phải tiến hành trong điều kiện tránh ánh sáng trực tiếp vì vitamin B2 khơng bền với ánh sáng.
- Các dung dịch chuẩn cần pha lại hàng tuần.
- Dùng nước cất 2 lần để hòa tan mẫu và định mức. - Hiệu chỉnh máy quang phổ trước khi đo mật độ quang.
3.2.2. Quy trình phân tích vitamin B2
Từ những điều kiện tối ưu đã khảo sát, ta xây dựng quy trình xác định vitamin B2
+ 5ml dd CH3COOH 2,5% + 100ml nước cất Lắc đều + 500ml nước cất + 30ml NaOH 1N Thêm nước Đo phổ ở λ=444nm
Hình 2 : Quy trình phân tích vitamin B2 trong dược phẩm
3.2.3.Phương pháp lấy mẫu
Lấy mẫu dược liệu là việc lựa chọn, thu thập các mẫu dược liệu cho việc kiểm tra chất lượng. Mức độ đại diện của các mẫu dược liệu được lấy có ảnh hưởng trực tiếp đến độ chính xác và độ đúng của việc kiểm tra.
Các yêu cầu chung về việc lấy mẫu dược liệu như sau:
Kiểm tra trước khi lấy mẫu Cách thức lấy mẫu
- Mẫu được mua ở các hiệu thuốc lớn trên thị trường Hà Nội
- Tại phịng thí nghiệm mẫu được trộn đều, xay mịn, đồng nhất và
phân tích. Mỗi mẫu sau khi đã trộn, được phân tích lặp lại 3 lần và có kèm một mẫu thêm chuẩn để xác định độ lặp lại và hiệu suất thu hồi trên từng đối tượng mẫu. Phần mẫu lưu cho vào trong túi đựng mẫu và bảo quản trong tủ mẫu.