Hình 1.14. Phối tử H2LM5 Hình 1.15. Phối tử H2LM7
1.2.3. Benzamiđin bốn càng
Cho đến nay, ngƣời ta mới biết đƣợc cấu trúc của các phức chất Ni(II), Cu(II) với phối tử benzamiđin bốn càng dẫn xuất từ điamin nhƣ etylenđiamin, o-phenylenđiamin [11], [21]. Cả hai phức chất này đều là những phức chất vuông phẳng, khi tạo phức, phối tử bốn càng tách hai proton nên mang điện tích, nó tạo liên kết với ion kim loại trung tâm qua hai nguyên tử N của hợp chất điamin và hai nguyên tử S của nhóm thioure:
1.3. Các phƣơng pháp nghiên cứu
Trong khuôn khổ những nghiên cứu của bản luận văn này, chúng tôi sử dụng các phƣơng pháp sau: phổ hồng ngoại IR, phổ cộng hƣởng từ 1H NMR, phổ khối lƣợng ESI-MS và phƣơng pháp nhiễu xạ tia X đơn tinh thể.
1.3.1. Phƣơng pháp phổ hồng ngoại IR
Theo vật lý lƣợng tử, một phân tử có ba dạng chuyển động cơ bản là: chuyển động của các electron, chuyển động dao động và chuyển động quay của các nguyên tử và nhóm nguyên tử [3]. Để thực hiện các chuyển mức dao động, phân tử phải hấp thụ những bức xạ trong vùng hồng ngoại.
Khi bị chiếu bởi một chùm bức xạ hồng ngoại đa sắc, vật chất thƣờng hấp thụ một phần của vùng sóng này, dẫn đến cƣờng độ chùm tia đi ra I thƣờng nhỏ hơn chùm tia tới Io. Tỷ số I/Io gọi là độ hấp thụ ánh sáng, nếu vẽ đƣờng biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ ánh sáng vào một đại lƣợng đặc trƣng cho bản chất ánh sáng, chẳng hạn số sóng ν(cm-1), ta sẽ thu đƣợc một đƣờng cong phức tạp, với những cực đại và cực tiểu. Đƣờng cong này gọi là phổ hấp thụ hồng ngoại của chất nghiên cứu [3].
Những quan sát phổ thực nghiệm của một lƣợng lớn các hợp chất chứa cùng một số nhóm nguyên tử giống nhau cho thấy rằng các nhóm này đều thể hiện những dải hấp thụ với tần số gần nhƣ giống nhau, từ đó ngƣời ta thống kê lại các tần số dao động này để làm tài liệu tra cứu. Bằng cách so sánh phổ thực nghiệm với phổ chuẩn của một hợp chất hay bảng thống kê tần số dao động của các nhóm nguyên tử, ta có thể nhận biết sự có mặt hay khơng của một nhóm chức nào đó ở chất nghiên cứu [3].
Phổ IR của phối tử H2L đƣợc đặc trƣng bởi hai dải hấp thụ, một có cƣờng độ trung bình ở vùng 3000 cm-1, và một có cƣờng độ mạnh ở vùng 1620 – 1660 cm-1
. Hai dải này đƣợc quy gán cho dao động hóa trị của N-H và C=C của vòng benzamiđin. Khi tạo phức chất, dải hấp thụ thứ nhất thƣờng biến mất do phối tử tách proton. Dải hấp thụ thứ hai thƣờng bị dịch chuyển sang vùng sóng dài; mức độ dịch chuyển cho phép dự đốn kiểu phối trí của H L. Nếu Δν > 120 cm-1 thì phối tử
tạo phức chất vịng càng và tách proton; nếu Δν = 40 ÷ 80 cm-1 thì phối tử tạo phức chất vòng càng nhƣng khơng tách proton; cịn nếu Δν < 40 cm-1
thì phối tử chỉ tạo phức chất qua C=S nhƣ các thioure đơn giản.
1.3.2. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ 1H-NMR
Hạt nhân nguyên tử gồm các proton và các notron. Số lƣợng tử spin của proton cũng nhƣ của notron đều bằng ½. Tùy thuộc vào việc spin của các hạt nucleon đó có cặp đôi hay không mà spin hạt nhân I của nguyên tử sẽ bằng không hoặc khác không. Nếu spin của tất cả các hạt nucleon đều cặp đơi thì số lƣợng tử spin hạt nhân I = 0, nếu ở hạt nhân có một spin khơng cặp đơi thì I = ½, nếu có nhiều spin khơng cặp đơi thì I 1 [1].
Một hạt nhân có I 0, khi đƣợc đặt trong một từ trƣờng ngoài Ho sẽ tách thành (2I + 1) mức năng lƣợng khác nhau. Mức năng lƣợng thấp nhất sẽ có mật độ phân bố lớn nhất. Thực nghiệm cho thấy hiệu số giữa các mức năng lƣợng này bằng năng lƣợng của các bức xạ điện từ thuộc vùng sóng vơ tuyến. Do vậy khi kích thích các hạt nhân bằng bức xạ vô tuyến tƣơng ứng, một số hạt nhân sẽ hấp thụ năng lƣợng để chuyển từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Thiết bị NMR sẽ ghi nhận sự hấp thụ này và sau khi xử lý sẽ in ra phổ tƣơng ứng [3].
Sự chênh lệch giữa mức năng lƣợng ở trạng thái kích thích và cơ bản phụ thuộc vào từ trƣờng tổng tác động lên hạt nhân. Từ trƣờng tổng này bao gồm từ trƣờng ngoài Ho và từ trƣờng phụ (từ trƣờng cảm ứng). Từ trƣờng phụ đƣợc gây ra bởi lớp vỏ điện tử xung quanh hạt nhân (sự chắn tại chỗ) và của các electron ở các nguyên tử bên cạnh (sự chắn từ xa). Các hạt nhân nằm trong mơi trƣờng có mật độ electron khác nhau sẽ cần các năng lƣợng khác nhau để đạt trạng thái cộng hƣởng [1].Trong phƣơng pháp NMR truyền thống (phƣơng pháp NMR sóng liên tục), từ trƣờng Ho đƣợc giữ cố định, chỉ thay đổi tần số vô tuyến (quét tần số). Các proton không tƣơng đƣơng nhau, sẽ cộng hƣởng ở các tần số khác nhau nên cần một thời gian quét sao cho toàn bộ proton lần lƣợt cộng hƣởng.
Phƣơng pháp NMR sử dụng đại lƣợng “độ dịch chuyển hóa học”, ký hiệu δ, để đặc trƣng cho các loại hạt nhân khác nhau. Đối với phổ 1HNMR, ngƣời ta chọn
chất chuẩn là tetrametylsilan Si(CH3)4, với quy ƣớc δcủa Si(CH3)4 bằng 0. Những proton cộng hƣởng ở mức năng lƣợng thấp (cộng hƣởng ở trƣờng yếu) sẽ có độ dịch chuyển hóa học cao. Các độ chuyển dịch hóa học của proton và các hạt nhân khác trong các “mơi trƣờng hóa học” khác nhau đƣợc tập hợp thành bảng trong các tài liệu tra cứu. Bằng cách sử dụng nguồn tƣ liệu này, kết hợp thêm một số tƣơng quan kinh nghiệm khác, ta có thể rút ra nhiều kết luận quan trọng về cấu tạo phân tử.
Phổ 1H-NMR của các benzamiđin thƣờng đƣợc đặc trƣng bởi sự quay hạn chế xung quanh liên kết (R1
R2N-CS). Nó làm cho các nhóm thế giống nhau gắn trên nguyên tử N có độ dịch chuyển hóa học khác nhau. Đặc biệt, trong phân tử của phối tử loại H2L có hai vị trí cứng nhắc đó là (R1R2N-CS) của hợp phần thioure và (R3R4N-CS) của hợp phần thiosemicacbazit. Chính điều này đơi khi gây khó khăn cho việc quy gán các tín hiệu cộng hƣởng trên phổ 1H-NMR của chúng. Khi có mặt nhân kim loại, độ linh động của các liên kết này có thể bị thay đổi, làm cho hình dạng và vị trí của các tín hiệu của R1
, R2, R3, R4 có thể bị thay đổi.
1.3.3. Phƣơng pháp phổ khối lƣợng ESI-MS
Nguyên tắc chung của phƣơng pháp phổ khối lƣợng là phá vỡ phân tử trung hòa thành ion phân tử và các ion mảnh có số khối A = m/z (m là khối lƣợng, z là điện tích ion), sau đó phân tách những ion này theo số khối. Dựa vào phổ khối lƣợng có thể xác định phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất nghiên cứu [1].
Q trình ion hóa phụ thuộc chủ yếu vào 3 yếu tố: cấu tạo của phân tử, phƣơng pháp bắn phá, năng lƣợng bắn phá. Có thể thực hiện quá trình này bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau nhƣ: phƣơng pháp va chạm electron (EI: electron ionization), phƣơng pháp ion hóa phun điện tử (ESI: electrospray ionization), phƣơng pháp ion hóa hóa học (CI: chemicalionization).
ESI là phƣơng pháp ion hóa phổ biến dùng cho nghiên cứu phức chất và phù hợp với các hợp chất kém bay hơi. Phƣơng pháp này có đặc điểm là q trình ion hóa xảy ra êm dịu.Trong kỹ thuật ESI, các ion dƣơng tạo thành có thể gắn thêm một proton và các ion âm tạo thành có thể mất bớt một proton, do vậy ion dƣơng [M+H]+ có khối lƣợng lớn hơn khối lƣợng phân tử một đơn vị và ion âm
[M – H]-có khối lƣợng nhỏ hơn khối lƣợng phân tử một đơn vị. Trong nhiều trƣờng hợp các ion dƣơng đƣợc tạo thành do kết hợp với các cation có sẵn trong dung dịch nhƣ Na+, K+, NH+4tạo nên các ion dƣơng [M+ Na]+, [M+ K]+, [M + NH4]+. Đối với phức chất chứa các phối tử mang điện tích âm linh động nhƣ các halogenua X-, ion dƣơng [M – X]+ có thể tạo thành khi các phối tử này bị tách ra khỏi phân tử.
1.3.4. Phƣơng pháp nhiễu xạ tia X đơn tinh thể
Khi chiếu tia X đi qua một đơn tinh thể của một chất cần nghiên cứu, tia X bị nhiễu xạ và tách thành nhiều tia X thứ cấp. Nếu đặt một phim chụp (hay một detector) phía sau tinh thể, ta có thể ghi lại hình ảnh của các tia nhiễu xạ là những nốt sáng. Hai thông tin thu đƣợc từ ảnh nhiễu xạ này là vị trí và cƣờng độ của tia nhiễu xạ. Từ những thơng tin này, bằng những tính tốn tốn học ta có thể xác định vị trí của từng nguyên tử có trong một ơ mạng cơ sở và từ đó xây dựng đƣợc cấu trúc phân tử trong không gian ba chiều của chất cần nghiên cứu.
Vị trí của các ảnh nhiễu xạ đƣợc giải thích bằng mơ hình phản xạ của Bragg. Trong đó, ảnh nhiễu xạ là kết quả của sự giao thoa các tia X phản xạ trên các họ mặt phẳng nút hkl. Mối liên hệ giữa vị trí của các ảnh nhiễu xạ và cấu trúc tinh thể, hay cụ thể hơn là các thông số mạng của tinh thể đƣợc thể hiện qua phƣơng trình Bragg:
2dhkl.sinθ = λ Trong đó:
dhkl là khoảng cách giữa hai mặt phẳng cạnh nhau trong họ mặt hkl, phụ thuộc vào các thơng số mạng.
θ là góc nhiễu xạ Bragg, đƣợc xác định dựa vào vị trí của các ảnh nhiễu xạ. λ là bƣớc sóng của tia X, phụ thuộc vào kim loại dùng làm đối âm cực.
Nhƣ vậy từ vị trí các nốt ảnh nhiễu xạ, ta có thể xác định đƣợc các thơng số mạng tinh thể của chất cần nghiên cứu.
Cƣờng độ của ảnh nhiễu xạ từ họ mặt phẳng hkl đƣợc biễu diễn thông qua thừa số cấu trúc F(hkl). Thừa số F(hkl)tỉ lệ thuận với căn bậc hai của bình phƣơng biên độ hàm sóng đƣợc tổ hợp từ các sóng nhiễu xạ tại các ngun tử trong ơ mạng cơ
sở. Trong trƣờng hợp tổng quát, nếu ta có N nguyên tử trong ô mạng cơ sở, nguyên tử thứ j chiếm vị trí (xj, yj, zj) thì thừa số cấu trúc và biên độ hàm sóng tổ hợp đƣợc tính theo cơng thức: Thừa số cấu trúc: 2 2 (hkl) (hkl) (hkl) F = A +B Trong đó: N (hkl) j j j j j=1 A =f .cos2π(hx +ky +lz ) N (hkl) j j j j j=1 B =f .sin2π(hx +ky +lz )
Trong đó fj là thừa số nhiễu xạ nguyên tử, có giá trị phụ thuộc vào số electron xung quanh hạt nhân hay nói cách khác phụ thuộc vào điện tích hạt nhân. Các nguyên tố khác nhau sẽ có thừa số nhiễu xạ fj khác nhau.
Nhƣ vậy nếu biết đƣợc bản chất của từng nguyên tử (biết fj) và vị trí của chúng trong ơ mạng cơ sở (xj, yj, zj), ta sẽ tính đƣợc thừa số cấu trúc F(hkl) ccho mọi ảnh nhiễu xạ. Cấu trúc phân tử của một chất chính là “mơ hình” cho các giá trị F(hkl) ctính tốn phù hợp nhất với các giá trị F(hkl) othu đƣợc từ thực nghiệm.
Để đánh giá độ chính xác giữa cấu trúc tính bằng lí thuyết tính tốn với số liệu thực nghiệm ngƣời ta sử dụng các phƣơng pháp thống kê. Trong đó, độ sai lệch R1 đƣợc tính bằng công thức [23]: (hkl) o (hkl) c hkl 1 (hkl) o hkl F - F R = F
Đối với các phân tử nhỏ (dƣới 100 nguyên tử) giá trị độ sai lệch R1 đƣợc chấp nhận trong khoảng dƣới 10%.
1.4. Thử hoạt tính sinh học
Các chất đƣợc đem thử hoạt tính sinh học bằng phƣơng pháp thử độ độc tế bào. Đó là phép thử nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thƣ ở điều kiện in vitro. Dòng tế bào ung thƣ đƣợc sử dụng ở nghiên cứu này là: MCF7 (Human breast carcinoma) - ung thƣ vú. Đây là tế bào ung thƣ ở ngƣời đƣợc cung cấp bởi Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật của Mỹ (American Type Culture Collection, viết tắt là ATCC). Các tế bào ung thƣ đƣợc nuôi cấy trong các mơi trƣờng ni cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phơi bị (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 370C; độ ẩm 98%, vô trùng tuyệt đối). Sau một thời gian cấy chuyển, tế bào phát triển ở pha lỗng sẽ đƣợc sử dụng để thử độc tính.
Mẫu thử đƣợc pha loãng ở các nồng độ là 128; 32; 8; 2; 0,5 μg/ml trong dung môi DMSO. Bổ sung thêm 200μl dung dịch tế bào ung thƣ MCF-7 ở pha loãng nồng độ 3.104 tế bào vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trƣờng RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute). Giếng điều khiển có 200μl dung dịch tế bào 3.104 tế bào /ml, ủ ở 370
C/5% CO2. Sau 3 ngày thêm 50μl MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), 1mg/ml pha trong môi trƣờng nuôi cấy không huyết thanh, và ủ tiếp ở 370C/4 giờ; loại bỏ môi trƣờng, thêm 100μl DMSO lắc đều, đọc kết quả ở bƣớc sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN.
Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào (Growth inhibition) = (OD điều khiển – OD mẫu) / OD điều khiển. Giá trị IC50 đƣợc tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào MCF-7 bằng phần mềm máy tính table curve. [17, 20]
CHƢƠNG 2 - THỰC NGHIỆM 2.1. Dụng cụ và hóa chất
2.1.1. Dụng cụ
- Bình cầu hai cổ (50 ml, 500 ml, 750 ml) - Phễu nhỏ giọt (100 ml)
- Phễu lọc thủy tinh đáy xốp - Sinh hàn có gắn bẫy dầu - Bình hút ẩm
- Máy khuấy từ gia nhiệt - Cân phân tích
- Máy lọc hút chân không
- Hệ thống cất quay chân không - Hệ thống làm khô dung môi - Tủ sấy - Tủ hốt 2.1.2. Hóa chất - Benzoylclorua (C6H5COCl) - KSCN - Ni(CH3COO)2.2H2O - [PdCl2(CH3CN)2] - Trietylamin(C2H5)3N - ClCH2COONa - Mopholin (morpholine): - C4H9N
- Thionyl clorua SOCl2 -C6H13N
- NH2NH2 - NaOH
- Chỉ thị benzophenon (C6H5)2CO - HCl
- Dung môi hữu cơ: axeton, metanol, etanol, đietyl ete, điclometan, cacbon tetraclorua, tetrahiđrofuran (THF), CS2.
2.1.3. Chuẩn bị hóa chất
KSCN đƣợc sấy khô trong tủ sấy ở 80oC cho đến khi khối lƣợng không đổi. Các dung môi dùng cho phản ứng tổng hợp phối tử đƣợc làm khô trong hệ thống làm khô dung môi. Axeton và cacbon tetraclorua đƣợc làm khô bằng P2O5. Trietylamin và THF đƣợc làm khơ bằng Na, có sử dụng chất chỉ thị benzophenon (khi đã khan nƣớc, chỉ thị từ không màu sẽ chuyển sang màu xanh).
2.2. Tổng hợp phối tử
Từ nguyên liệu ban đầu là benzoyl clorua và các amin (C4H9N hoặc C6H13N), phối tử benzamiđin ba càng sẽ đƣợc tổng hợp qua 5 công đoạn:
2.2.1. Tổng hợp hai dẫn xuất của benzoylthioure
Sơ đồ tổng hợp:
Lắp hệ thống phản ứng gồm bình cầu hai cổ 500ml, một cổ lắp sinh hàn có gắn bẫy dầu, một cổ lắp phễu nhỏ giọt 100 ml. Cho 58 ml benzoyl clorua
(dbenzoyl clorua = 1,21 g/ml, ~ 0,5 mol) vào phễu nhỏ giọt, cho thêm khoảng 20ml
axeton khơ, rồi nhỏ từ từ vào bình cầu hai cổ chứa 53g KSCN sấy khơ (~0,55 mol) đã hịa tan trong axeton khan, khuấy đều bằng máy khuấy từ và đun nóng ở nhiệt độ 50oC trong 2h, để nguội bình phản ứng về nhiệt độ phòng rồi tiếp tục nhỏ từ từ 56,8ml đietylamin (dđietylamin = 0,7074 g/ml,~0,55 mol) hoặc 47,5ml morpholin
(dmopholin = 1,007 g/ml, ~0,55 mol) trong axeton vào bình phản ứng, khuấy đều hỗn
trong 2h. Khi phản ứng kết thúc, để nguội bình phản ứng về nhiệt độ phịng rồi rót hỗn hợp phản ứng vào cốc dung tích 1000 ml chứa nƣớc cất, khuấy nhẹ bằng đũa
thủy tinh sau đó lọc hút trên phễu thủy tinh đáy xốp thu đƣợc dẫn xuất của benzoylthioure ở dạng rắn màu trắng hơi vàng. Làm khơ sản phẩm trong khơng khí thu đƣợc: 90,5 g đietylbenzoylthioure (HEt2-Btu), hiệu suất ~ 75% và 95 g
morpholinbenzoylthioure (HMor-Btu) , hiệu suất ~ 76%.
2.2.2. Tổng hợp hai dẫn xuất phức chất niken(II) benzoylthioureato
Sơ đồ tổng hợp:
[Ni(Et2-btu)2]: R1 = R2 = Etyl [Ni(Mor-btu)2]: NR1R2 = Mopholin
Hòa tan 0,3 mol benzoylthioure trong etanol nóng trong cốc chịu nhiệt 500
ml, thêm dần dung dịch chứa 32 g muối Ni(CH3COO)2.2H2O (~0,15 mol) trong
metanol nóng vào dung dịch trên. Vừa khuấy vừa đun nóng nhẹ trong vịng 15 phút, sau đó để nguội về nhiệt độ phòng. Thấy xuất hiện kết tủa màu đỏ tím đối với