Ư NG 2 NG NƯ NG NG IÊN CỨU
2.1. NGUYÊN L IU
2.1.1. Mẫu nghiên cứu
126 c p mẫu mô gồm mô u và mô lân c n u (LCU) của 126 bệnh nh n UTĐTT cùng với các thông tin của bệnh nhân ược cung cấp từ Kho Giải phẫu bệnh - T bào, Bệnh viện K và Bệnh viện Quân Y 103. Mẫu nghiên cứu ược thu th p từ năm 2012 n năm 2016. Trong Bệnh viện K cung cấp 86 c p mẫu mô, Bệnh viện Quân Y 103 cung cấp 40 c p mẫu mơ và có kèm theo 40 mẫu máu ngoại vi của các bệnh nh n tương ứng, mẫu máu ược lấy trước khi phẫu thu t. Đối tượng nghiên cứu ký giấy ồng ý tham gia nghiên cứu và cho mẫu (Phụ lục5).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi quan tâm và thu th p thông tin v một số c i m như ộ tuổi, giới tính, vị tr k h thướ u ộ biệt h v gi i oạn bệnh của bệnh nh n UTĐTT y l những i m phản ánh mứ ộ và ti n tri n củ ung thư. Trong ộ biệt h v gi i oạn bệnh (theo phân loại TNM) ược phân chia theo tiêu chuẩn của tổ chứ ung thư Ho Kỳ [18], ộ tuổi x p thành 2 nhóm là trên 50 và dưới 50 tuổi (vì theo thống kê của tổ chứ ung thư Ho kỳ thì trên 90% số ca mắc UTĐTT ượ xá ịnh sau 50 tuổi [25], vị tr ung thư ược chia thành hai nhóm là ung thư ại tràng và trực tràng theo cấu tạo giải phẫu. K h thước khối u ược chia th nh 3 nh m: k h thước nhỏ hơn 3 m; từ 3 n 3,5 cm và lớn hơn 3 5 m.
Tuy nhiên, trong 126 bệnh nh n ung thư th m gia nghiên cứu, một số bệnh nhân chúng tôi không thu th p ượ ầy ủ á th ng tin như: 2 bệnh nhân thi u thông tin v ộ tuổi, 7 bệnh nhân thi u thông tin v k h thước u, 3 bệnh nhân thi u thông tin v gi i oạn bệnh và 34 bệnh nh n kh ng xá ịnh ược mứ ộ biệt hóa.
nh sá h bệnh nh n v một số thông tin v i m bệnh họ ủa từng bệnh nh n UTĐTT phi u lấy mẫu ược trình bày ở các Phụ lục 3 và Phụ lục 6. Thống kê số lượng mẫu theo i m bệnh học của 126 bệnh nh n UTĐTT ược trình bày trong Bảng 2.1.
Bả 2.1. T ố ố ợng mẫu TĐTT ặ ể ệ ọ Đặ ểm Số ợng Độ tuổi tuổi < 50 23 ≥ 50 101 Giới tính Nam 64 Nữ 62
Vị tr ung thư Đại tràng 85 Trự tr ng 41 Mứ ộ biệt hóa Rõ 38 Vừa 47 Kém 7 K h thước u (cm) <3 25 >=3; <=3,5 26 >3,5 68 Gi i oạn T T1 9 T2 41 T3 46 T4 27 Gi i oạn N N0 75 N1 37 N2 11 Gi i oạn bệnh Gi i oạn I 35 Gi i oạn II 39 Gi i oạn III 47 Gi i oạn IV 2
Ghi chú: T: Tumor (khối u), N: Node (hạ ) M: M t st s s ( ăn), đoạn I:
T1-2N0M0; đoạn II: T3-4N0M0; đoạn III: T bất kỳ N1-2M0; đoạn IV: T bất kỳ N bất kỳ M1.
Ngoài ra, 67 mẫu máu củ người khỏe mạnh ượ Kho S ng lọ máu Viện Huy t học và Truy n máu Trung ương ung ấp ượ d ng l m ối chứng với mẫu máu của bệnh nh n ung thư.
Các mẫu nghiên cứu ược thu th p v v n huy n từ Bệnh viện v Phòng th nghiệm bằng b nh nitơ lỏng ho c hộp á lạnh và bảo quản ở tủ lạnh -800C (với mẫu mô) và -250 ( ối với mẫu máu) chuẩn bị cho các phân tích ti p sau.
Tiêu chuẩn l a chọn mẫu u t
- Mẫu ược Bệnh viện cung cấp từ những bệnh nh n ược phẫu thu t với mụ h i u trị bệnh.
- Mẫu ược chẩn oán xá ịnh bằng xét nghiệm mô bệnh học tại Kho Giải phẫu bệnh - T b o ủ Bệnh viện l UTĐTT nguyên phát, dạng ung thư bi u mô tuy n.
- Mẫu của những bệnh nh n m k t tự nguyện tham gia nghiên cứu (Phụ lục 5) và có hồ sơ bệnh án lưu trữ.
- Mẫu mô sau khi phẫu thu t ược rửa bằng ệm Kali phosphate 100mM, pH 8 0 v ược chia vào các ống 1,5 ml riêng biệt chuẩn bị tách chi t ADN tổng số.
- Đối với mẫu máu: Máu ngoại vi ược chống ng bằng E T ược tách huy t tương. Máu ượ lưu trữ trong các ống chống ng bảo quản ở tủ lạnh -250C.
Tiêu chuẩn loại trừ không lấy mẫu
Bệnh nhân bị UTĐTT do ung thư ở á ơ qu n khá di ăn n, bệnh nh n qu i u trị hóa trị, xạ trị, UTĐTT tái phát ho c mẫu m bị hoại tử.
Vị trí lấy mẫu
Đối với mẫu mô: Mẫu m ược lấy tại hai vị trí là tại khối u (gọi là mơ u) và vị trí cách khối u tối thi u 5 cm (gọi là mô lân c n u- L U) m L U ượ xá ịnh là diện cắt khơng có t b o ung thư.
2.1.2. Các hóa chất
Các hóa chất h nh ược dùng trong nghiên cứu và mụ h sử dụng ược trình bày trong Bảng 2.2
Bả 2.2. a ấ ợ ử ụ ứu STT Hóa chất Hãng cung cấp Mụ
1.
QIAamp ADN Mini Kit, QI GEN Đức
Tá h hi t ADN tổng số Blood Genomic ADN Isolation
Mini Kit Norgen, Canada
2. Agarose Invitrogen, Mỹ Điện di
3. Các c p mồi d ng ho ph n t h PCR-R LP xá ịnhmất oạn, Real-time PCR IDT, Mỹ PCR
Hot Start PCR Master Mix 2x Thermo Scientific, Mỹ
4. qPCR BIO SyGreen Mix LO-
ROX 2X Biosystem, Anh
Real-time PCR
5. Các enzyme cắt giới hạn erment s Đức; New England
Biolabs (NEB), Anh PCR-RFLP
6. CloneJET PCR Cloning Kit Thermo Scientific, Mỹ Nh n dòng 7. GeneRuler 100bp ADN Ladder Thermo Scientific, Mỹ ADN chuẩn
Các hóa chất cịn lại u ạt ộ sạch phân tích cho nghiên cứu sinh học phân tử.