3.1. BI N Đ I CỦA CÁC GEN ND1, ND3, COX-1 VÀ COX-2TY TH
Các gen ND1, ND3, COX-1 và COX-2 mã hóa cho các protein thuộc phức hệ hô hấp I và IV ty th [133]. Bi n ổi tại một số vị trí thuộ á gen n y ược xác ịnh ở ung thư vú [6, 32, 43, 67, 106] ung thư buồng trứng [79] ung thư phổi [123], UTĐTT [19,36] và một số dạng bệnh lý khác [125]. Tuy nhiên, mối liên quan giữa các bi n ổi với ung thư c biệt là mối liên quan với á i m bệnh học của ung thư òn hư ượ xá ịnh rõ ràng. Vì v y, trong khn khổ lu n án n y húng t i lự họn s ng lọc t p trung vào 5 loại bi n ổi gồm T4216C, A4164G thuộc gen ND1, A10398G thuộc gen ND3 (hai gen thuộc phức hệ hô hấp I) và
C6340T thuộc gen COX-1, G7853A thuộc gen COX-2 (hai gen thuộc phức hệ hô
hấp IV) trên 86 c p mẫu mô u và mô LCU của 86 bệnh nh n UTĐTT do bệnh viện K cung cấp qu t m hi u mối liên quan của các bi n ổi này với một số i m bệnh học của bệnh UTĐTT. á bi n ổi T4216C, A4164G, A10398G, C6340T và G7853 ược sàng lọc bằng phương pháp P R-RFLP ho c giải trình tự trực ti p từ sản phẩm P R ược nhân lên từ khn là ADN ty th có trong ADN tổng số ược tách chi t từ các mẫu nghiên cứu (k t quả tách chi t ADN tổng trình bày ở Phụ lục 3 và Phụ lục 4) với các c p mồi và enzyme phù hợp.
3.1.1. Biế ổ 4164G T4216 ủa ND1 ở bệ â u i trực tràng
3.1.1.1. ịnh bi i A4164G và m t s bi i khác
Bi n ổi 4164G v T4216 v ủ gen ND1 ượ xá ịnh bằng phương pháp PCR-R LP. Đầu tiên, chúng tôi thi t k c p mồi (ND1-1F, ND1-1R) bằng hương trình Primer-BLAST trong NCBI[132] dựa trên trình tự tham chi u của ADN ty th (mã số NC_012920.1). Trình tự và vị trí bắt c p của c p mồi ược trình bày trong Bảng 2.3. Sử dụng c p mồi n y nh n oạn ADN k h thước 335 bp chứa vị trí 4216 và 4164 thuộc gen ND1 ty th . S u húng t i họn enzyme NlaIII xác
enzyme NlaIIIcho thấy: n u mẫu khơng có bi n ổi tại vị trí 4164 và vị trí 4216 thì
sản phẩm PCR sẽ không bị enzyme này cắt và giữ nguy n k h thước 355 bp; en- zyme NlaIII sẽ cắt sản phẩm P R th nh 2 oạn k h thước 185 bp và 150 bp n u mẫu có bi n ổi tại vị trí 4164 ho th nh 2 oạn 205 bp và 130 bp n u mẫu có bi n ổi tại vị trí 4216. N u mẫu ồng thời cả hai bi n ổi tại vị trí 4164 và vị trí 4216 thì sản phẩm PCR sau khi cắt bằng enzyme NlaIII sẽ 3 b băng k h thước
150, 130 và 55 bp. K t quả iện di sản phẩm PCR từ c p mồi (ND1-1F, ND1-1R) và sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn NlaIII của một số mẫu ại diện trong nghiên
cứu ược minh họa trong Hình 3.1.
Hình 3.1. ện di sản phẩm PCR từ cặp mồi (ND1-1F và ND1-1R) và sản phẩm của ợc cắt bằng enzyme giới h n NlaIII(gel agarose 2%, nhuộm EtBr)
Giếng M: Thang ADN chu n 100bp. Giến ,3,5 s n p P R; ến 2,4,6 s n p ắt n t n n ủ ột số mẫu nghiên c u
Hình 3.1 ho thấy sản phẩm P R ở á gi ng 1 3 5 u một băng rõ n t k h thướ băng tương ứng 335 bp úng theo t nh toán khi thi t k mồi. Như v y p mồi (N 1-1 N 1-1R) thi t k l hiệu nh n bản oạn ADN thuộ gen
ND1 hứ vị tr 4164 v 4216. Sản phẩm cắt bằng enzyme NlaIII ượ iện di ở các
gi ng 2 4 6; trong gi ng 2, 6 sản phẩm cắt cho một băng k h thướ tương ứng 335 bp th hiện là mẫu khơng có bi n ổi tại vị trí 4216 và 4164, gi ng 4 minh họa cho mẫu có bi n ổi hồn tồn có th ở vị trí 4164 ho c 4216.
Đ khẳng ịnh những mẫu có sản phẩm cắt bằng enzyme ho h i băng l bi n ổi tại vị trí 4216 hay 4164 thì sản phẩm PCR từ tất cả các mẫu n y ược giải trình tự ADN,
bên cạnh một mẫu mà sản phẩm PCR không bị cắt bằng enzyme (mẫu khơng có bi n ổi) ũng ược giải trình tự. K t quả giải trình tự ược minh họa ở Hình 3.2.
Hình 3.2. Trình tự n ADN uộ ND1 ứa ị 4216 4164
Hình A: Mẫu khơng bị biến đổi tại vị trí 4216 và 4164
n : Mẫu không bị biến đổi tại vị trí 42 6 n n ến đổi tại vị trí 4164 Dấu chấm minh h t o đoạn ADN từ vì trí 4169-4213
K t quả giải trình tự khẳng ịnh, tất cả những mẫu có sản phẩm PCR bị cắt th nh h i băng bởi enzyme NlaIII u là mẫu có bi n ổi tại vị trí 4164 khơng có
bi n ổi tại vị tr 4216. Hơn nữa, k t quả giải trình tự ũng ho thấy tại vị trí 4164 chỉ có một ỉnh G trong trường hợp có bi n ổi ho ỉnh trong trường hợp khơng có bi n ổi, do v y có th k t lu n bi n ổi A4164G tồn tại ở dạng ồng t bào chất.
Ngoài ra, k t quả giải trình tự ịn xá ịnh ược một số vị trí bi n ổi khác thuộc gen ND1 gồm: G4048A, C4071T, T4108C, C4137T và A4263G, các bi n ổi n y ũng tồn tại ở dạng ồng t bào chất (Hình 3.3). Trong bi n ổi G4048A l m th y ổi axit amin từ Aspatate (D) thành Asparagine (N) tại vị trí 248 (D248N) của phân tử protein NADH dehydrogenase của ti u phần I thuộc vùng xuyên màng trong ty th . Đ c biệt, bi n ổi T4108 m húng t i xá ịnh ược là bi n ổi mới hư ược công bố trong ơ sở dữ liệu ng n h ng gen ty th MITOMAP [125]. Một i u thú vị là ba bi n ổi G4048A, C4071T và A4164G xu hướng xuất hiện cùng nhau trong cùng một mẫu nghiên cứu, những bệnh nh n m ng ồng thời cả ba bi n ổi n y th u ở gi i oạn T1 và T2. Tuy nhiên, liệu ba bi n ổi này xuất hiện cùng nhau là ngẫu nhiên hay là hệ quả của nhau và ảnh hưởng củ húng n ti n tri n của bệnh UTĐTT vẫn là những câu hỏi cần ược nghiên cứu ti p.
Hình 3.3. Trình tự n gen ND1 có chứa một số biế ổi khác
Biến đổi tại các vị trí 4048 (A), 4108(B), 4071(C), 4137(D), 4263 (E)
3.1.1.2. T n suất c a bi 4164 v qu vớ ọ Đ
Tổng hợp k t quả PCR-RFLP và giải trình tự húng t i s ng lọ ược 11/86 (12,8%) bệnh nhân có bi n ổi tại vị trí 4164. Tính tốn thống kê cho thấy khơng có sự khác biệt v bi n ổi này giữa mô u và mô LCU. Số liệu chi ti t v bi n ổi A4164G thuộc gen ND1 ty th của từng bệnh nh n ược trình bày trong Phụ lục 8.
Đối với UTĐTT á i m bệnh họ như vị tr ung thư k h thướ u ộ biệt h gi i oạn bệnh h y ộ tuổi và giới tính là những y u tố li n qu n n nguy ơ mắ ung thư ho c phản ánh mứ ộ củ ung thư. V v y tìm hi u mối liên quan giữa tần suất của bi n ổi A4164G với một số i m bệnh học k trên của bệnh nh n UTĐTT húng t i d ng ki m ịnh h nh xá ủa Fisher ho c ki m ịnh Khi b nh phương t y theo tần suất của bi n ổi, k t quả ki m ịnh ượ tr nh b y trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Tần suấ ố ua ủa biế ổ 4164G ớ ặ ể ệ ọ ủa TĐTT Đặ ểm Số ợng Tầ uấ 4164G % (n) p 4164A 4164G Tuổi <50 18 83,3 (15) 16,7 (3) 0,695* >=50 66 87,9 (58) 12,1 (8) Giới t nh Nam 41 75,6 (31) 24,4 (10) 0,003* Nữ 45 97,8 (44) 2,2 (1) Vị trí ung thư Đại tràng 45 88,9 (40) 11,1 (5) 0,625** Trự tr ng 41 85,4 (35) 14,6 (6) Độ biệt hóa Rõ 10 80,0 (8) 20,0 (2) 0,585* Vừ 39 84,6 (33) 15,4 (6) Kém 6 100 (6) 0,0 (0) K h thước u (cm) <3 21 85,7 (18) 14,3 (3) 0,256* >=3; <=3,5 16 75,0 (12) 25,0 (4) >3,5 42 90,5 (38) 9,5 (4) Gi i oạn N No 51 92,2 (47) 7,8 (4) 0,096* N1 và N2 32 75,0 (25) 25,0 (7) Gi i oạn T T1 9 55,6 (5) 44,4 (4) 0,011* T2 35 85,7 (30) 14,3 (5) T3 và T4 40 95,0 (38) 5,0 (2) Gi i oạn bệnh I 30 86,7 (26) 13,3 (4) 0,063* II 21 100 (21) 0,0 (0) III và IV 33 78,8 (26) 21,2 (7)
Ghi chú:*: Giá trị p nhận đ ợc từ ể địn s r, **: Giá trị p nhận đ ợc từ ể địn
K n p n (χ2)
Bảng 3.1 cho thấy bi n ổi 4164G li n qu n với giới t nh v gi i oạn T (p<0,05) với tần suất dạng bi n ổi (4164G) o hơn ở nam giới so với nữ giới, cao nhất ở gi i oạn T1 (44,4%) và giảm dần ở á gi i oạn T2 và T3,4. K t quả này gợi ý bi n ổi A4164G có th li n qu n n gi i oạn ầu xâm lấn của khối u. Ngoài ra, bi n ổi 4164G kh ng li n qu n với á i m khác như ộ tuổi k h thước khối u, mứ ộ biệt h gi i oạn N v gi i oạn bệnh ủa bệnh UTĐTT (p>0 05).
Theo thống kê trên MIOTOMAP, bi n ổi 4164G hư ượ xá ịnh ở bệnh nh n UTĐTT v v y các k t quả húng t i thu ược v tần suất và mối liên quan của bi n ổi với một số i m bệnh học củ UTĐTT người Việt Nam là dữ liệu mới, giúp cung cấp thêm thông tin v tần suất và mối liên quan của bi n ổi A4164G với một số i m bệnh học củ UTĐTT.
Đ c biệt, khác với nghiên cứu của Akouchekian và cs (2011) [19] tìm ra sự phổ bi n của ột bi n T4216C (có 8/30 bệnh nhân có bi n ổi T4216C) trên nhóm bệnh nhân UTĐTT người Iran, nghiên cứu của chúng tôi không thấy ột bi n này khi s ng lọ 86 p mẫu m UTĐTT người Việt Nam. Đi u này cho thấy ột bi n T4216 kh ng trưng v l dạng hi m g p ở bệnh nh n UTĐTT người Việt Nam.
Tổng k t lại, các k t quả nghiên cứu v bi n ổi của gen ND1 cho thấy tần suất bi n ổi A4164G ở mẫu m ủa bệnh nh n UTĐTT người Vi t N m l 11/86 (12 8%). Bi n ổi n y kh ng li n qu n với á i m như ộ tuổi k h thước khối u, vị trí khối u v gi i oạn phát tri n UTĐTT (p>0 05) nhưng li n qu n với giới tính v gi i oạn T củ người bệnh (p<0 05). Ngo i r húng t i òn xá ịnh ược các bi n ổi khá l G4048 4071T T4254 T4108 v 4137T trong bi n ổi G4048 l m th y ổi axit amin; ba bi n ổi G4048A, C4071T và A4164G lu n i k m với nhau trong cùng một mẫu nghiên cứu, các mẫu n y u ở gi i oạn T1 ho c T2.
3.1.2. Biế ổi A10398G thuộc gen ND3 ở bệ â i trực tràng
Bi n ổi 10398G ũng ượ xá ịnh bằng phương pháp P R-R LP. Trước tiên, c p mồi 10398 ược thi t k bằng hương tr nh Primer-BLAST trong NCBI [132] dựa trên trình tự tham chi u của ADN ty th (mã số N 012920.1) nhân oạn ADN k h thước 246 bp chứa vị trí 10398 thuộc gen ND3 ty th . Trình tự và vị trí bắt c p của mồi ược trình bày trong Bảng 2.3.S u enzyme DdeI ược chọn xá ịnh bi n ổi tại vị 10398. Phân tích vị trí nh n bi t của enzyme này cho thấy: trường hợp mẫu khơng có bi n ổi tại vị trí 10398 (10398A) thì sản phẩm PCR sau khi cắt bằng enzyme DdeI ho 2 băng k h thước 196 bp và 50 bp. Trong
cho 3 băng k h thướ 158 bp 50 bp v 38 bp. Hơn nữ khẳng ịnh k t quả PCR-RFLP, một số mẫu ược giải trình tự. K t quả P R-R LP v giải tr nh tự ược minh họa trong Hình 3.4. Số liệu chi ti t v bi n ổi A10398G của từng bệnh nhân ược trình bày trong Phụ lục 8.
Hình 3.4. ện di sản phẩm PCR-RFLP và trình tự n ADN chứa vị trí 10398 (gel agarose 2,5%, nhuộm EtBr)
n : ếng M: Thang chu n ADN 50 bp, giếng 1, 3: s n ph m PCR: giếng 2, 4 s n ph m cắt bằn n t n ng của mẫu nghiên c u, giến 5: đối ch n n s n
ph m cắt bằn n đoạn ADN ch a vị trí 10398 dạn 0398 v (đã đ ợc khẳng định bằng gi i trình t ) đ ợc trộn lại v n u, ến 6: đối ch n , n : ết qu
gi i trình t đoạn ADN ạn 0398 v 0398
Hình 3.4A cho thấy, ở gi ng 2 là mẫu dạng 10398A vì sản phẩm PCR sau khi cắt bằng enzyme DdeI ho 2 băng k h thướ tương ứng 196, 50 bp, gi ng 4 là mẫu dạng 10398G vì sản phẩm PCR sau khi cắt bằng enzyme DdeI ho 3 băng k h
thướ tương ứng158 bp 50 bp v 38 bp (băng 38 bp do k h thước nhỏ n n tr i r ngoài bản gel khi iện di). K t quả PCR-RFLP ượ khẳng ịnh l h nh xá bằng giải trình tự (Hình 3.4B).
Tổng hợp k t quả sàng lọc bi n ổi 10398G húng t i xá ịnh ược 50/86 (58,1%) bệnh nhân có bi n ổi A10398G trên mơ u ho m L U. Trong tr n mô u tần suất bi n ổi là 47/86 mẫu (chi m 54,7%), trên mô LCU là 49/86 mẫu (chi m 56,9%). Sự khác biệt v tần suất bi n ổi A10398G giữa mô u và mô LCU kh ng ý nghĩ thống kê (p>0,05).
Sử dụng ki m ịnh chính xác của Fisher ho Khi b nh phương (χ2) ánh giá mối liên quan giữa bi n ổi A10398G với á i m bệnh học của bệnh UTĐTT k t quả ược tr nh b y trong Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Tần suấ ố ua ủa biế ổ 10398G ớ ặ ể ệ ọ ủa ệ TĐTT Đặ ểm ố ợng Tầ uấ 10398G (%) n P 10398A 10398G Tuổi <50 18 22,2 (4) 77,8 (14) 0,07 ** >=50 66 45,5 (30) 54,5 (36) Giới t nh Nam 41 39,0 (16) 61,0 (25) 0,61 ** Nữ 45 44,4 (20) 55,6 (25)
Vị tr ung thư Đại tràng 45 33,3 (15) 66,7 (30)
0,09 ** Trự tr ng 41 51,2 (21) 48,8 (20) Độ biệt hóa Rõ 10 40,0 (4) 60 (6) 1,00* Vừ 39 43,6 (17) 56,4 (22) Kém 6 50,0 (3) 50,0 (3) K h thước u (cm) <3 21 23,8 (5) 76,2 (16) 0,11** >=3; <=3,5 16 56,3 (9) 43,8 (7) >3,5 42 45,2 (19) 54,8 (23) Gi i oạn N No 51 49,0 (25) 51,0 (26) 0,11 ** N1và N2 32 37,0 (10) 63,0 (22) Gi i oạn T T1 9 0,0 (0) 100 (9) 0,03* T2 35 45,7 (16) 54,3 (19) T3 và T4 40 47,5 (19) 52,5 (21) Gi i oạn bệnh I 30 43,3 (13) 56,7 (17) 0,37** II 21 52,4 (11) 47,6 (10) III và IV 33 33,3 (11) 66,7 (22) Ghi chú:*: Giá trị p nhận đ ợc từ ể địn s r, **: trị p nhận đ ợc từ ể địn K n p n (χ2)
Bảng 3.2 cho thấy bi n ổi 10398G li n qu n với gi i oạn T (p<0 05) c biệt tần suất dạng bi n ổi (10398G) cao nhất ở gi i oạn T1 (100%) và giảm dần ở á gi i oạn T2 và T3,4. K t quả này gợi ý rằng bi n ổi A10398G có liên quan với gi i oạn ầu xâm lấn của khối u. Ngoài ra, k t quả ki m ịnh cho thấy khơng có mối liên quan giữa bi n ổi 10398G với ộ tuổi, giới t nh k h thước khối u, mức ộ biệt h gi i oạn N v gi i oạn bệnh ủa bệnh UTĐTT (p>0 05).
Bi n ổi A10398G trên gen ND3 ượ xá ịnh ở các bệnh thối hóa thần kinh Parkinson, Alzheimer [58, 112], hội chứng chuy n hóa [71]. ũng á công bố v mối liên quan của loại bi n ổi n y với bệnh ung thư tuy nhi n á k t quả òn hư thống nhất c biệt với ung thư vú [32, 43, 67]. Riêng với ối tượng UTĐTT dữ liệu nghiên cứu li n qu n n bi n ổi A10398G hầu như òn hư .
Trong nghiên cứu n y húng t i xá ịnh ược tần suất và mối liên quan giữa bi n ổi A10398G với một số i m bệnh học của một nhóm bệnh nh n UTĐTT người Việt Nam. Đ c biệt, 9/9 (100%) bệnh nh n UTĐTT ở gi i oạn T1 u có bi n ổi A10398G. M d ơ h tá ộng của bi n ổi A10398G với ung thư hư ược hi u rõ nhưng nghi n ứu chỉ ra rằng, chính sự h nh tại vị trí 10398 trong gen ND3 có th làm giảm hiệu quả v n chuy n iện tử của chuỗi v n chuy n
iện tử trong phức hệ hô hấp ty th l m tăng tố ộ rò rỉ iện tử v gi tăng sự hình thành các gốc ROS do v y có th li n qu n n quá tr nh phát sinh ung thư [32].
Hơn nữa, k t quả nghiên cứu của chúng tơi cịn cho thấy có 9/11 bệnh nhân có bi n ổi A4164G thuộc gen ND1 th ũng bi n ổi A10398G trên gen ND3 (Phụ
lục 8) và cả hai bi n ổi n y u liên quan với mứ ộ xâm lấn khối u (gi i ọan T) với t lệ bi n ổi cao nhất ở gi i oạn T1. Những i u này gợi ý rằng hai bi n ổi 4164G v 10398G xu hướng xuất hiện cùng nhau và có th có vai trị trong gi i oạn ầu của quá trình xâm lấn của khối u.
Trên ối tượng UTĐTT húng t i hư thấy ng bố n o nghi n ứu s u v bi n ổi A10398G. V v y k t quả nghi n ứu này g p phần ung ấp th m th ng tin v tần suất v mối li n qu n giữ bi n ổi 10398G với một số i m bệnh họ ủ bệnh UTĐTT người Việt N m.