) Tri Tô n đối chứng Tân Hồng ô nhiễm
3.2.3 Mối tƣơng quan giữa ô nhiễm asen trong nƣớc giếng khoan, nƣớc đã lọc với hàm lƣợng các dạng asen methyl hoá trong nƣớc tiểu
với hàm lƣợng các dạng asen methyl hoá trong nƣớc tiểu
Nghiên cứu về thành phần các dạng asen chuyển hố trong cơ thể từ asen vơ cơ trong nước ăn uống là vấn đề mới, mang tính thời sự đối với các nhà khoa học về độc học môi trường. Các kết quả nghiên cứu độc học asen trước đây đã cho rằng methyl hoá là con đường chuyển hố asen chính ở động vật có vú. Ở người, sau khi tiếp xúc với asen vô cơ qua hít thở hoặc nước uống thì phần lớn asen được thải ra ngoài qua nước tiểu với các dạng khác nhau. Trong đó, dạng asen vơ cơ chiếm 10 - 30%, dạng monomethylasen (MMAs) chiếm 10 - 20%, dạng dimethylasen (DMAs) chiếm 60 - 70%. Nhìn chung, tổng các dạng asen methyl hoá chiếm khoảng 70 – 90% và tỉ lệ này cũng có khác nhau giữa các quần thể và cá thể [24, 91]. Như vậy, sau khi thu nhận asen vơ cơ, q trình trao đổi chất đã đưa asen từ dạng vơ cơ sang dạng methyl hố và cơ thể chịu tác động chủ yếu của các dạng asen này. Bản chất hữu cơ của các hợp chất asen methyl hoá làm tăng khả năng thâm nhập tế bào của chúng cũng như các tác động sinh học đối với cơ thể [33]. Các kết quả nghiên cứu theo hướng này nhằm góp phần cung cấp bằng chứng minh hoạ cơ chế gây độc của asen ở người hiện đang được bàn cãi [84, 87, 92, 93]. Trong phần này, chúng tơi trình bày các kết quả thu được khi nghiên cứu mối tương quan giữa hàm lượng các dạng asen methyl hoá trong nước tiểu với ô nhiễm asen trong nước giếng khoan, nước đã lọc.
Để có kết quả về thành phần các dạng asen trong nước tiểu, chúng tơi đã phân tích mẫu tại trường đại học Tổng hợp Ehime, Nhật bản trên thiết bị IC- ICPMS. Sắc ký đồ biểu diễn sự phân giải của các thành phần asen trong mẫu chuẩn và mẫu nước tiểu được minh hoạ trên hình 3.20. Đường nét mảnh là sắc đồ của dung dịch chuẩn chứa 25 µg/l các dạng asen đã ghi chú, đường nét đậm là của mẫu nước tiểu. Độ phân giải của phép phân tích đảm bảo tách hồn tồn các dạng methyl hố ra khỏi dạng vơ cơ và asenobetain (AsB). Nhìn chung trong các mẫu phân tích chúng tơi ít gặp As(V) và thường ở mức rất thấp nên tổng số asen trong nước tiểu chỉ gồm asenobetain (AsB), asenit (As(III)), dimethyl asen (DMAs) và monomethyl asen (MMAs).
Hình 3.20 Sắc ký đồ thu được khi phân tích các dạng asen trong nước tiểu. Cột sắc ký trao đổi anion (Hamilton PRP-X100, 25 cm X 4,1 mm) và pha động là 6.7 mM NH4H2PO4 (pH 6,0), tốc độ dòng 1,0 ml/phút. Pic 1 – asenobetain (AsB) và asenit (As III), pic 2- DMAs (axit dimethylasinic), pic 3- MMAs (axit monomethylasonic), pic 4- asenat (AsV).
Bảng 3.5 trình bày các kết quả về hàm lượng trung bình asen trong nước giếng khoan, nước đã lọc, hàm lượng trung bình các dạng asen methyl hoá trong nước tiểu. Ở nhóm đối chứng, mức phơi nhiễm asen trong nước sinh hoạt là 6 µg/l, lượng asen methyl hố là 38 ng/mg creatinin. Ở nhóm phơi nhiễm thấp (Lý Nhân), asen trong nước sinh hoạt là 31 µg/l, lượng asen methyl hố là 46 ng/mg creatinin (p<0,5). Ở nhóm phơi nhiễm cao (Hồi Đức) các giá trị này tương ứng là 153 µg/l và 99 ng/mg creatinin (p<0,001). Kết quả thu được ở đây thể hiện khá phù hợp khi so sánh với kết quả của tác giả Tokunaga nghiên cứu tại Ấn Độ. Với mức phơi nhiễm asen 227 µg/l, hàm lượng asen methyl hố trung bình là 193,6 ng/mg creatinine [87]. Như vậy tổng lượng các dạng asen methyl hố, chứ khơng phải là tất cả các dạng asen trong nước tiểu, có tương quan rất chặt chẽ với mức phơi nhiễm asen. Ví dụ, tổng lượng asen trong nước tiểu tại các mẫu đối chứng (75 ng/mg
0.E+001.E+04 1.E+04 2.E+04
0 300 600 900 1200 1500
Thời gian lưu (giây)
Cư ờ n g đ ộ t ín h iệ u
Dung dịch chuẩn 25 ug/L mẫu 20B
DMA
MMA
Âs(V) AB +As(III)
creatinin) lại cao hơn tại điểm ô nhiễm thấp (58 ng/mg creatinin). Điều này có thể giải thích là: ở nhóm đối chứng có những cá thể có nhiều asenobetain trong nước tiểu liên quan tới việc ăn hải sản, hợp chất này làm cho tổng lượng asen tăng lên chứ không liên quan tới việc dùng nước có chứa asen vơ cơ [92].
Bảng 3.5 Hàm lượng asen trong nước tiểu, nước giếng và nước sinh hoạt (đã lọc hoặc dùng trực tiếp). Số liệu in nghiêng là Min – Max
Địa điểm Số lƣợng mẫu As trong nƣớc giếng (µg/l) As trong nƣớc đã lọc (µg/l) As trong nƣớc tiểu (ng/mg creatinine) MMAs + DMAs Tổng số Đối chứng 17 6 1-12 6 Dùng trực tiếp 38 11-86 75 26-140 Lý Nhân 35 435 311-598 31 1-167 46 (p<0,5) 10-88 58 10-129 Hoài Đức 82 330 184-426 153 56-309 99 (p< 0,001) 23-315 127 30-437 (Ghi chú: Do số lượng cá thể cho mẫu tóc và nuớc tiểu tại cùng một điểm - Lý Nhân, Hoài Đức, Từ Liêm - là khác nhau nên giá trị asen phơi nhiễm trung bình có khác nhau - bảng 3.2 và 3.4).
Mối quan hệ giữa hàm lượng asen methyl hoá với asen trong nước giếng khoan, nước giếng khoan đã lọc được thể hiện trên hình 3.21. Tương tự như hình 3.19 mối tương quan giữa giá trị biểu hiện của biomarker và mức độ phơi nhiễm chỉ có thể tìm được nếu ta xác định đúng nguồn phơi nhiễm thực sự. Ở đây, tương quan có hệ số hồi quy r = 0,998 đối với nước thực dùng và r = 0,384 đối với nước giếng khoan. Một lần nữa ta thấy rằng để đánh giá nguy cơ nhiễm độc asen, việc xác định đúng nguồn phơi nhiễm là rất quan trọng.
Hình 3.21 Tương quan giữa hàm lượng asen methyl hoá trong nước tiểu và hàm lượng asen trong nước giếng khoan, nước sinh hoạt (giá trị trung bình)
Xét chi tiết tỉ lệ các dạng asen methyl hoá so với tổng lượng asen trong nước tiểu của từng cá thể tại mỗi khu vực nghiên cứu ta thấy tỉ lệ này là 55,3% với tương quan chưa chặt (r = 0,687) tại điểm đối chứng (hình 3.22) và 81% với tương quan chặt hơn nhiều (r = 0,980) tại các điểm có phơi nhiễm asen (hình 3.23). Tỉ lệ tương tự cũng đã được tìm thấy ở các quần thể có phơi nhiễm asen khác trên thế giới, ví dụ tại Ấn Độ là 86,7%[94], và 77,6% [60], tại Mêhicô là 84,9% [93]. Như vậy, kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, với các cá thể phơi nhiễm asen vô cơ từ nước uống, cơ thể sẽ luôn chứa một lượng lớn các asen đã methyl hố chứ khơng phải asen vô cơ nữa (>80%).
0 30 60 90 120 0 100 200 300 400 500
As trong nước (ug/L)
M M A + D M A t ro n g n ư ớ c t iể u ( n g /m g c re a ti n in e )
Nước sinh hoạt Nước ngầm
r = 0,998
Hình 3.22 Tương quan giữa hàm lượng asen methyl hoá với asen tổng số trong nước tiểu của các thể không phơi nhiễm asen
Hình 3.23 Tương quan giữa hàm lượng asen methyl hoá với asen tổng số trong nước tiểu của các thể phơi nhiễm với asen ở mức độ khác nhau.
35 µg/l - hình trịn 110 µgl - hình tam giác
Kết quả nghiên cứu trên động vật thí nghiệm của các tác giả khác cho thấy, các sản phẩm methyl hố của asen trong cơ thể có độc tính cho cả tế bào và gen.
R2 = 0.47210 0 30 60 90 120 150 0 30 60 90 120 150 Tổng As (ng/mg creatinine) M M A +D M A ( ng /m g cr ea tin in e) r = 0,687 R2 = 0.9619 0 100 200 300 400 0 200 400 Tổng As (ng/mg creatinine) M M A + D M A ( ng /m g cr ea tin in e) 153 ug/L 31 ug/L r = 0,980
Trong một tài liệu tổng quan, tác giả Kenyon đã cho thấy hợp chất DMAs(V) là chất gây ung thư. Hợp chất này kích thích sự bẻ gãy các sợi ADN đơn trong tế bào mô phổi chuột nhắt, chuột đồng và người khi nghiên cứu in vitro. Cơ chế gây ung thư ở đây được cho là do sự tạo thành các gốc peroxyl của DMAs và các dạng ơxy hoạt động [47]. Sử dụng các mơ hình động vật khi nghiên cứu bản chất gây ung thư của asen, tác giả Wanibuchi cũng cho thấy DMAs là tác nhân gây độc cho hệ gen như làm đứt gãy ADN, tạo trao đổi chéo ở nhiễm sắc thể [96]. Khi nghiên cứu một số tác động của các dạng asen vô cơ và hữu cơ lên tế bào trứng chuột đồng Trung Quốc, tác giả Dopp và các cộng sự thấy rằng có sự tăng số lượng các nhân con, biến đổi nhiễm sắc thể, tăng tần số trao đổi nhiễm sắc tử chị em khi xử lý tế bào với DMAs(III) và MMAs(III). Tiềm năng gây độc cho hệ gen tế bào trong nghiên cứu này được sắp xếp theo thứ tự giảm dần như sau: DMAs(III) > MMAs(III) > Asen vô cơ (III và V) > MMAs(V) > DMAs(V) > TMAsO(V). Sự khác biệt về độc tính này được giả thiết liên quan tới tính thấm qua màng tế bào của các chất kể trên [33]. Như vậy, có thể những tác hại cho cơ thể từ phơi nhiễm với asen là do độc tính của các dạng asen methyl này. Mặc dù hiện nay trên thế giới các nhà khoa học vẫn đang tranh cãi về vai trị của q trình methyl hố asen vơ cơ từ nước uống là con đường giải độc hay gây độc thì những kết quả nghiên cứu thực tế trên đây cũng đã đưa ra những dữ liệu về một hiện trạng nhiễm độc asen lâu dài và đang tiếp diễn ở một số khu vực tại Việt Nam. Các kết quả về tương quan giữa hàm lượng các dạng asen methyl hố và mức phơi nhiễm sẽ góp phần cung cấp số liệu thực tiễn cho các giả thiết về cơ chế sự trao đổi chất của asen trong cơ thể và mối liên quan tới sức khoẻ.
Khi kết hợp các số liệu về mức tích luỹ asen trong tóc, asen hữu cơ trong nước tiểu và asen trong nước sinh hoạt tại ba điểm nghiên cứu trên ta có hình 3.24. Mẫu đối chứng ký hiệu là RU1, mẫu tại Lý Nhân ký hiệu là RU2, và tại Hoài Đức ký hiệu là RU3. Kết quả cho thấy, sự phơi nhiễm asen trong nước sinh hoạt đã làm tăng sự tích luỹ asen trong tóc cũng như các dạng asen methyl hố trong nước tiểu, đặc biệt là ở Hoài Đức (RU3).
As_NL (ug/L) DMA+MMA (ng/mg creatinine) As_Toc X 50(mg/kg) Tu Liêm Lý Nhân Hồi Đuc 0 40 80 120 160
Hình 3.24 Tương quan giữa mức độ ơ nhiễm asen trong nước sinh hoạt, asen trong tóc và asen methyl hố trong nước tiểu (các đơn vị để ở bảng chú thích ký hiệu)
Như vậy các biomarker tóc và nước tiểu có tương quan thuận với nhau. Nếu coi tóc là chỉ thị nhiễm độc asen lâu dài và nước tiểu là chỉ thị nhiễm độc hiện tại thì người dân tại điểm Hoài Đức đã phơi nhiễm asen trường diễn cho tới hiện nay. Các dấu hiệu này đã cung cấp bằng chứng cận lâm sàng để các bác sĩ chuyên khoa có thể tiếp cận và điều tra sự có mặt của các bệnh asen điển hình tại khu vực này.
Về ý nghĩa thực tiễn, ở Lý Nhân tuy nước giếng khoan bị ô nhiễm asen nặng nề, nhưng việc sử dụng biomarker đã chứng minh rằng dân cư ở đó bị thâm nhiễm asen chưa nhiều. Lý do là vì nước sinh hoạt ở đó đã được loại bỏ hầu hết asen (hơn 90%). Ngoài ra việc dùng thêm nước mưa trong mùa hè cũng là một trong những nguyên nhân hạn chế sự xuất hiện bệnh nhân nhiễm độc asen [6]. Cịn ở Hồi Đức, tuy ơ nhiễm asen trong nước giếng khoan có thấp hơn ở Lý Nhân, nhưng biomarker đã cho thấy sự thâm nhiễm asen lại nhiều hơn. Lý do là nước sinh hoạt ở đó có hàm lượng asen cao hơn ở Lý Nhân (hình 3.24). Kết quả này gợi ý cho các nhà nghiên
cứu y học môi trường một địa chỉ có nguy cơ mắc bệnh liên quan tới asen. Các kết quả tìm được cũng cho thấy vai trị rất tích cực của việc sử dụng bể lọc cát để giảm thiểu phơi nhiễm asen, trong khi chưa có các biện pháp khác tích cực hơn.
Như vậy, để góp phần đáp ứng một số nội dung của chương trình hành động quốc gia về asen, luận án đã hoàn thành việc thực hiện hai mục tiêu
Chọn lựa và tối ưu phương pháp phân tích hàm lượng asen trong nước giếng khoan bằng biosensor sử dụng vi khuẩn chỉ thị
Đánh giá mối tương quan giữa ô nhiễm asen trong nước giếng khoan với mức độ thâm nhiễm asen trên người
phục vụ cho chủ đề của luận án là “ Nghiên cứu sử dụng các chỉ thị hoá sinh để
đánh giá mức độ ô nhiễm asen trong nƣớc giếng khoan và mối tƣơng quan với thâm nhiễm asen trên ngƣời”
Kết quả thu được của luận án góp phần vào việc đưa tiến bộ cơng nghệ sinh học vào phục vụ bảo vệ môi trường thông qua việc nghiên cứu ứng dụng biosensor cho phân tích asen trong nước. Luận án cũng cung cấp các bằng chứng về ô nhiễm asen trong nước sinh hoạt, mức độ thâm nhiễm trên người, đề xuất giải pháp giảm nhẹ nhiễm độc asen bằng việc sử dụng bể lọc cát. Tác giả luận án hy vọng góp một phần nhỏ bé vào sự nghiệp chăm sóc sức khoẻ ban đầu cho cộng đồng, đặc biệt là cho người dân nông thôn Việt Nam.
KẾT LUẬN
Sau khi thực hiện các nội dung nghiên cứu, bản luận án có những kết luận sau: 1. Thử nghiệm ba chủng vi khuẩn biến đổi gen, chỉ thị với asen tại điều kiện
Việt Nam cho thấy chủng E. coli luxAB đáp ứng vai trò là biosensor cho việc xác định hàm lượng asen trong nước giếng khoan. Các chủng E. coli lacZ và
E. coli gfp cho kết quả ở dạng bán định lượng.
2. Đã tối ưu hoá và xây dựng được quy trình phát hiện, đánh giá hàm lượng asen trong nước giếng khoan bằng vi khuẩn chỉ thị E. coli luxAB. Các thông số đã tối ưu là thời gian tiếp xúc với mẫu (90 phút) và lượng cơ chất n- decanal (1 mM). Việc bổ xung HNO3 tới nồng độ 0,015 mM đã hạn chế sự kết tủa của sắt cũng như sự hấp phụ của asen lên các kết tủa đó. Đường chuẩn biểu diễn tương quan giữa hàm lượng asen trong mẫu và cường độ ánh sáng phát ra có hệ số hồi quy r = 0,996, với đáp ứng tuyến tính trong khoảng 0 – 80 g/l.
3. Đã thử nghiệm độ tin cậy của biosensor vi khuẩn chỉ thị asen E. coli luxAB
trên 410 mẫu nước giếng khoan. So sánh với kết quả thu được bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử cho thấy độ sai lệch âm là 4,7%, độ sai lệch dương là 3,4%. Với cả hai loại sai số đều nhỏ hơn 5%, biosensor này thể hiện khả năng ứng dụng thực tiễn để phân tích asen trong nước giếng khoan.
4. Hàm lượng trung bình asen trong mẫu tóc và hàm lượng trung bình asen methyl hố trong nước tiểu là những biomarker đáng tin cậy để đánh giá mức độ thâm nhiễm asen. Mối tương quan giữa các giá trị trung bình về ơ nhiễm asen trong nước sinh hoạt và thâm nhiễm asen trên người có hệ số hồi quy là r = 0,967 cho mẫu tóc và r = 0,998 cho mẫu nước tiểu.
5. Mức độ phơi nhiễm asen ở người tại một số điểm tại Việt Nam là đáng báo động. Kết quả phân tích các mẫu tóc cho thấy tại các điểm đối chứng, hàm lượng asen trung bình trong tóc nằm trong khoảng 0,23 – 0,27 mg/kg, còn tại các điểm ơ nhiễm, ví dụ Hoài Đức - Hà Tây, mức tích luỹ asen trung bình của 255 mẫu tóc là 1,71 mg/kg (p<0,01), 64,7 % số mẫu tóc có hàm lượng asen lớn hơn 1 mg/kg, (1mg/kg là mức nhiễm độc theo số liệu của Tổ chức Y
tế Thế giới). Sự tích luỹ asen trong tóc ở trẻ em (2,60 mg/kg, n=45, p<0,05) thể hiện cao hơn ở người lớn (1,5mg/kg).