Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2.3.Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.3.Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro
2.2.3.1. Tạo mô sẹo từ hạt lúa
+ Khử trùng hạt: Hạt lúa chín đƣợc bóc bỏ vỏ trấu, lắc nhẹ trong cồn 70% 1phút, 25 phút trong nƣớc gia ven 60%, rửa sạch bằng nƣớc cất vô trùng 3 - 5 lần, thấm khơ hạt trên đĩa petri có trải giấy lọc vơ trùng.
+ Tạo mơ sẹo: Hạt gạo đã khử trùng đƣợc cấy vào bình tam giác chứa mơi
trƣờng MS cơ bản [34], bổ sung 2,4-D 2mg/l, saccharose 3%, agar 0,9%, pH=5,8. Mỗi bình cấy khoảng 18 hạt, nuôi một tuần trong tối, 2 tuần dƣới ánh sáng đèn trong phịng ni cấy với cƣờng độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ phịng ni 250
C ± 10C. Đánh giá tỷ lệ tạo mô sẹo sau 3 tuần nuôi cấy theo công thức:
Số hạt tạo mô sẹo
% tạo mô sẹo = x 100% (2.3) Tổng số hạt
2.2.3.2. Phương pháp xử lý thổi khô mô sẹo
Mô sẹo sau 3 tuần nuôi đƣợc cắt thành những miếng mơ nhỏ có kích thƣớc 3mm x 3mm. Đặt những miếng mơ sẹo lên đĩa petri có lót giấy lọc vơ trùng và thổi khơ mơ sẹo bằng luồng khơng khí vơ trùng của buồng cấy ở các ngƣỡng thời gian khác nhau. Xác định độ mất nƣớc của mô sẹo sau 2, 4, 6, 8 giờ xử lý. Độ mất nƣớc của mô sau khi xử lý thổi khơ đƣợc tính theo cơng thức:
% 100 % f d f L W W W W (2.4)
Trong đó Wf: Trọng lƣợng mô tƣơi (mg) WL: Độ mất nƣớc (%)
Wd: Trọng lƣợng mô sau thổi khô (mg)
2.2.3.3. Tái sinh cây
Mô sẹo sau xử lý mất nƣớc đƣợc cấy lên môi trƣờng tái sinh. Mật độ cấy 18 mơ/bình. Ni dƣới ánh sáng đèn trong phịng ni cấy với cƣờng độ 2000 lux, thời
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ phịng ni 250
C ± 10C. Khả năng sống sót của mơ sẹo đƣợc đánh giá sau 4 tuần nuôi phục hồi.
% 100 (%) t sv N N Sv (2.5) Trong đó: Sv: Tỷ lệ mơ sống sót (%) Nsv: Số mơ sống sót Nt: Tổng số mô xử lý
Khả năng tái sinh cây đƣợc đánh giá sau 6 tuần nuôi theo công thức:
(%) 100%
Nsv Nr
Rc (2.6)
Trong đó: Rc: Khả năng tái sinh (%)
Nsv: Số mơ sống sót Nr: Số mô tái sinh cây