Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây mạ

Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.4. Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây mạ

Phƣơng pháp đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây mạ đƣợc xác định theo Lê Trần Bình và CS (1998) [3].

Chuẩn bị: Cát vàng đãi sạch, phơi khô sàng và loại bỏ những hạt to, cho vào

bát nhựa. Hạt thóc ngâm trong nƣớc 3 sơi 2 lạnh trong 24 giờ. Gieo các mầm lúa của các dòng chọn lọc và giống gốc vào các bát, mỗi bát gieo khoảng 30 hạt. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần trong điều kiện và chế độ chăm sóc nhƣ nhau. Trong 3 ngày đầu tƣới nƣớc cho đủ độ ẩm, các ngày sau tƣới dung dịch MS pha loãng 10 lần. Tới khi mạ đƣợc 3 lá tiến hành gây hạn nhân tạo và đánh giá khả năng chịu hạn của các giống và các dòng chọn lọc bằng cách xác định tỷ lệ thiệt hại và chỉ số hạn tƣơng đối.

 Xác định tỷ lệ cây sống sót (%)

Tỷ lệ cây sống sót = Số cây sống x 100% (2.7)

Tổng số cây xử lý

 Xác định khả năng giữ nước qua các giai đoạn xử lý bởi hạn theo cơng thức

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Wfc

Trong đó: W(%): Khả năng giữ nƣớc của cây sau khi xử lý bởi hạn Wft(g): khối lƣợng tƣơi của cây sau khi xử lý bởi hạn (g) Wfc(g): Khối lƣợng tƣơi của cây không xử lý (g)

 Xác định tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra được tính theo công thức

A = Σ (N0b)

x 100% (2.9)

NC

Trong đó: A: Tỷ lệ thiệt hạn do hạn gây ra (%) b: trị số thiệt hại của mỗi cấp

C: trị số thiệt hại của cấp cao nhất No: số cây của mỗi cấp thiệt hại N: tổng số cây xử lý

Các trị số: Số cây chết: trị số 3; Số cây héo: trị số 1; Số cây không bị ảnh hƣởng: trị số 0.

 Xác định chỉ số chịu hạn tương đối theo công thức 1

sin ( ... )

2

n

S   abbc cd  de  ja (2.10)

Trong đó Sn: chỉ số chịu hạn tƣơng đối của các giống, các dịng chọn lọc

: góc tạo bởi 2 trục mang trị số gần nhau và tính bằng 360/x

a: % cây không héo sau 3 ngày hạn b: % cây phục hồi sau 3 ngày hạn c: % cây không héo sau 5 ngày hạn d: % cây phục hồi sau 5 ngày hạn e: % cây không héo sau 7 ngày hạn f: % cây phục hồi sau 7 ngày hạn

g: % tỷ số khối lƣợng khô của rễ/thân lá trƣớc khi gây hạn (%KLK) h: % tỷ số khối lƣợng khô của rễ/thân lá sau hạn 3 ngày (%KLK) i: % tỷ số khối lƣợng khô của rễ/thân lá sau hạn 5 ngày (%KLK) j: % tỷ số khối lƣợng khô của rễ/thân lá sau hạn 7 ngày (%KLK)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

2.2.5. Phƣơng pháp sinh học phân tử 2.2.5.1. Tách chiết ADN tổng số từ lá lúa

 Kỹ thuật thu và bảo quản lá

Hạt lúa chín đƣợc bóc vỏ trấu, chọn những hạt sạch cho vào lọ thuỷ tinh có nút nhám và khử trùng theo trình tự sau: khử trùng trong cồn 700

thời gian 1 phút, trong nƣớc javen chứa 1% NaClO thời gian từ 15-20 phút (lắc đều), sau đó rửa sạch bằng nƣớc cất vô trùng 4 – 5 lần. Đặt lên đĩa Petri, có lót giấy thấm vơ trùng, để hạt khô.

Hạt gạo đã khử trùng đƣợc cấy lên môi trƣờng MS cơ bản (Murashige and Skoog, 1962 [46]), bổ sung sucrose 1% + agar 0,8%, pH=5,8. Mật độ cấy 10-15 hạt/bình, ni cấy ở cƣờng độ chiếu sáng 2000lux, thời gian 10/24 giờ, nhiệt độ 250C. Sau 2 tuần, cắt thu lấy lá dùng ngay hoặc bảo quản ở tủ lạnh sâu -200

C.

 Tách ADN tổng số

Quy trình tách ADN tổng số từ lá lúa đƣợc cải tiến dựa theo phƣơng pháp tách ADN của Foolad & CS., (1995) [33] có cải tiến. Dung dịch ADN tổng số đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% và bằng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ ở bƣớc sóng 260nm và 280nm.

 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng và độ sạch của ADN

Điện di trên gel agarose

- Pha agarose 0,8% trong TBE 0,5X, đun nóng, để nguội khoảng 600

C đổ vào khn gel 30ml có cài lƣợc.

- Sau 30 phút tháo lƣợc ra, đổ đệm chạy điện di TBE 0,5X ngập bảng gel 1mm. - Lấy 2μl ADN mẫu + 3μl dye trộn đều.

- Chạy điện di: 80V, 30 phút.

- Nhuộm gel: nhuộm gel bằng Ethidium bromide 0,5μg/ml trong 10 phút, rửa sạch bằng nƣớc.

- Soi gel trên đèn UV và chụp ảnh.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Xác định hàm lƣợng và độ tinh sạch của ADN trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 260nm/280nm.

- Cho 995μl nƣớc cất và 5μl ADN mẫu vào cuvet (hệ số pha loãng 200 lần), lắc đều đặt vào máy đo.

Hàm lƣợng và độ sạch ADN đƣợc tính theo cơng thức: Hàm lƣợng ADN (ng/ml) =50 x HSPL x OD260

Độ sạch ADN = OD 260/OD280 Trong đó: HSPL: hệ số pha loãng

OD260: chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 260nm 50: hằng số

OD280: chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 280nm.

Nếu tỷ lệ OD260/OD280 = 1,8 – 2,0 thì mẫu ADN đƣợc coi là đủ tiêu chuẩn về độ sạch.

2.2.5.2. Tách dòng và đọc trình tự gen GA2ox1

Nhân gen GA2ox1 bằng PCR từ ADN genome lúa

Dựa vào thơng tin của trình tự gen GA2ox1 đƣợc cơng bố trong trong tài liệu của Lê Xuân Đắc [7] có mã số trên ngân hàng gen (Genbank) OSJNBa0017J22.4, sử dụng cặp mồi EX2-3-F và EX2-3-R để nhân đoạn gen GA2ox1 trên dòng chọn lọc R4.05.

Khuếch đại gen GA2ox1 bằng PCR

Chu kỳ nhiệt nhân gen GA2ox1 theo các bƣớc sau: 940

-3 phút; 940-50 giây, 530-50 giây, 720-50 giây lặp lại 25 chu kỳ; 720-10 phút và lƣu giữ ở 40C (Sambrook & Russell, 2001) [52].

Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR

- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm

- Bổ sung đệm hoà tan (QG) theo tỉ lệ: Vmẫu : VQG = 1 : 3 (1μl tƣơng ứng 1mg mẫu). - Ủ ở 500 trong 15 phút, 3 phút trộn nhẹ một lần, sau khi gel tan hết ủ thêm 5 phút cho gel tan hồn tồn.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột gel Qiaquick spin colum, ly tâm 13000v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.

- Bổ sung 500μl dung dịch QG, ly tâm 13000v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy

qua cột.

- Thêm 700μl đệm rửa (PE) vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.

- Ly tâm 13000v/p trong 1 phút, loại dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút để loại hết PE.

- Hoà tan ADN trong 30μl–50μl H2O khử ion, khử trùng đã đƣợc làm ấm 500C để ở nhiệt độ phòng 1 phút sau đó ly tâm 13000v/p trong 1 phút.

Gắn gen vào vector tách dòng và biến nạp vector tái tổ hợp

- Sản phẩm PCR làm sạch từ thơi gen đƣợc gắn vào vector tách dịng pBT sử dụng bộ kit pGEM – T System.

- Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng: ADN, Ligation buffer 10X, vector pBT, T4 ligase.

- Hỗn hợp đƣợc ủ ở 220C trong 2 giờ, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến

E.coli DH5α.

- Tế bào khả biến lấy từ tủ -850C đƣợc để trong đá 15-30 phút. Sau đó, bổ sung 20μl vector tái tổ hợp vào ống đựng tế bào khả biến sau đó trộn nhẹ nhàng bằng đầu pipet. Hỗn hợp đƣợc ủ 40

C trong 30 phút, rồi ủ ở 420

C chính xác 1 phút và sau đó ủ 40C trong đá 5 phút.

- Bổ sung 300μl môi trƣờng LB lỏng, hỗn hợp đƣợc nuôi ở 370C, lắc 200v/p trong 1giờ. Sử dụng que cấy trải, trải 150μl - 550μl dịch khuẩn lên đĩa mơi trƣờng LB đặc có chứa 100mg/l ampicillin, X-gal 0,004‰, IPTG 100μM, ủ đĩa ở 370

C trong 16 giờ.

Chọn dòng bằng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc

Sau khi biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli, chọn lọc trên

mơi trƣờng thạch có chứa 100mg/l ampicillin, X-gal 0,004‰, IPTG 100μM, ủ đĩa ở 370C trong 16 giờ sẽ thu đƣợc các khuẩn lạc xanh trắng. Chọn 10 khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu để tiến hành phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC18-F1/pUC18-

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

R1(có trình tự bắt cặp mồi trên vector và cách nhau khoảng 0,2kb). Thành phần phản ứng colony-PCR tƣơng tự nhƣ trong phản ứng PCR chỉ khác cặp mồi sử dụng và mẫu ADN thay bằng khuẩn lạc. Điện di sản phẩm colony-PCR trên gel agarose 1% để chọn ra các khuẩn lạc chứa plasmit nhƣ mong muốn. Đồng thời, nuôi những khuẩn lạc này trong 3 ml mơi trƣờng LB lỏng có bổ sung ampicillin 100mg/l nhằm mục đích tách plasmit.

Tách Plasmit

- Tách plasmit đƣợc sử dụng đệm chiết TELT: 0,5M Tris-HCl pH=7,5; 0,5M EDTA pH=8,0; 1M LiCl; Trion X-100.

- Thành phần dung dịch lysozym: lysozym; 0,5M Tris-HCl pH=7,5; 0,5M EDTA pH=8,0.

Quy trình:

- Chọn 3 khuẩn lạc trắng riêng rẽ, ni trên mơi trƣờng LB lỏng có bổ sung 50mg/l ampicillin qua đêm ở 370

C.

- Lấy 2ml dịch khuẩn đã nuôi qua đêm cho vào ống eppendorf 2ml, ly tâm 10000v/p trong 7 phút, loại dịch.

- Bổ sung 200μl TELT, 10μl lysozym, khuấy tan để khuẩn tan hết.

- Để nhiệt độ phòng trong 5 phút, ủ ở 950 trong 3 phút, ủ 40C trong 5 phút, ly tâm 13000v/p trong 15 phút.

- Hút dịch nổi sang ống eppendorf 1,5ml, bổ sung một lƣợng tƣơng đƣơng isopropanol, ly tâm 13000v/p trong 15 phút.

- Loại dịch nổi, rửa tủa 2 lần bằng cồn 70%. - Làm khơ plasmit bằng máy Speed Vac.

- Hồ tan Plasmit trong 40 ml nƣớc cất khử ion khử trùng. - Bổ sung 0,1μl RNase, ủ ở 370C trong 2 giờ.

- Tinh sạch plasmit để đọc trình tự.

Quy trình tinh sạch plasmit

- Bổ sung PB theo tỉ lệ Vmẫu : VPB = 1 : 5, mix nhẹ.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Loại dịch, ly tâm bổ sung 1 phút để loại sạch đệm rửa. Cho cột tinh sạch vào ống eppendorf 1,5ml.

- Bổ sung 30μl nƣớc khử ion khử trùng, để nhiệt độ phòng 1-2phút, ly tâm 13000v/p trong 1 phút.

Phương pháp xác định trình tự nucleotit

Trình tự gen GA2ox1 đƣợc xác định trên máy đọc tự động ABI PRISM®

3100 Avant Genetic Analyzer sử dụng bộ kit BigDye®

Terminator v3.1 Cycle Sequencing, dựa trên nguyên tắc của phƣơng pháp Sanger có sử dụng các dideoxiribonucleotit. Kết quả đọc trình tự gen đƣợc xử lý bằng phần mềm DNAstar và BioEdit.

Phương pháp xử lý trình tự gen thu được

Việc so sánh và xử lý trình tự gen GA2ox1 đƣợc tiến hành theo trình tự sau: - So sánh trình tự gen đƣợc đọc từ hai đầu xi và đầu ngƣợc để xác định trình tự đầy đủ và đúng của gen.

- BLAST trình tự đầy đủ của gen với các trình tự gen trong NCBI để xác định gen đƣợc tách dịng là của GA2ox1.

- Giải mã trình tự nucleotit sang trình tự axit amin theo một khung đọc mở.

- Lập bảng hệ số đồng dạng so sánh mức độ tƣơng đồng di truyền của các trình tự nucleotit của các dòng gen thu đƣợc với nhau và với trình tự gen đã đƣợc cơng bố trong Ngân hàng gen quốc tế (Genbank).

2.2.6. Phƣơng pháp xử lý kết quả và tính tốn số liệu

Phân tích các tính trạng số lƣợng theo phƣơng pháp thống kê sinh học. Mỗi cơng thức thí nghiệm và đối chứng lấy ngẫu nhiên 30 cây. Các giá trị thống kê nhƣ trị số trung bình mẫu (X ), phƣơng sai (2), độ lệch (), sai số trung bình mẫu (sx), hệ số biến động (Cv%), hệ số tƣơng quan (R)... đƣợc xử lý trên máy vi tính bằng chƣơng trình excel, theo Nguyễn Hải Tuất và Ngơ Kim Khôi (1996) [23].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Chƣơng 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Đặc điểm nông học các dòng lúa chọn lọc ở thế hệ R3, R4 và giống gốc có nguồn gốc từ mơ sẹo chịu mất nƣớc nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nƣớc

3.1.1. Đặc điểm nơng học các dịng lúa chọn lọc ở thvà giống gốc

Các dòng chọn lọc và giống gốc sau khi đƣợc gieo trên khay đƣợc đƣa ra ngồi ruộng đều có khả năng sinh trƣởng phát triển bình thƣờng (hình 3.1). Sau thời gian tiến hành theo dõi, đánh giá các chỉ tiêu nông học trong vụ mùa 2008, kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.1.

Hình 3.1. Các dịng chọn lọc và giống gốc thế hệ R3 (vụ mùa 2008)

- Chiều cao cây

Chiều cao cây đƣợc đo từ mặt ruộng đến đầu bơng. Tính trạng về chiều cao cây của các dòng chọn lọc và đối chứng đƣợc sắp xếp theo thứ tự: R3.04 > KD > R3.06 > R3.05 > R3.07; U17 > R3.16; R3.11 > CR203. Kết quả cho thấy, dòng R3.04 có nguồn gốc từ KD có chiều cao tăng so với đối chứng 8,53cm, các dịng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

R3.05, R3.06, R3.07 có chiều cao giảm so với đối chứng từ 1,63cm - 1,92cm. Dòng R3.11 có nguồn gốc từ CR203 có chiều cao tăng hơn so với giống gốc 0,54cm. Dịng R3.16 có chiều cao giảm so với giống gốc là 16,9cm. Trong số 6 dòng theo dõi thì có 3/6 dịng (chiếm 50%) có hệ số biến động (Cv%) nhỏ hơn so với đối chứng. Dòng R3.11 đƣợc chọn lọc từ giống CR203 có hệ số biến động cao nhất là 4,81%, các dòng còn lại dao động từ 2,64% - 4,30%.

Hình 3.2. Các dịng R3.04, R3.05 và Khang dân (vụ mùa 2008)

- Chiều dài bông

Chiều dài bông thay đổi tùy theo từng dòng và nguồn gốc của mỗi dòng. Chiều dài bơng của cả 4 dịng có nguồn gốc từ giống KD đều lớn hơn so với giống gốc. Dòng R3.06 có chiều dài bơng là 24,0cm tăng 0,68cm so với đối chứng (23,33cm). Dịng R3.11 có nguồn gốc từ giống CR203 có chiều dài bơng 23,56cm tăng 0,49cm so với giống gốc (23,07cm). Dòng R3.16 của giống U17 có chiều dài bơng 23,18cm giảm 1,12cm so với đối chứng (24,3cm). Chiều dài bông của 3/6 dịng R3 (chiếm 50%) có hệ số biến động nhỏ hơn so với đối chứng. Giống KD gốc có hệ số biến động là 5,97%, các dịng chọn lọc có nguồn gốc từ giống này hệ số biến động dao động từ 4,06% (dòng R3.06) đến 6,73% (dòng R3.05). Điều này chứng tỏ đã có sự ổn định nhanh tính trạng chiều dài bơng của các dịng chọn lọc ở thế hệ R3.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Kích thƣớc hạt

Kích thƣớc và hình dạng hạt liên quan trực tiếp đến năng suất lúa, từ kết quả thu đƣợc cho thấy kích thƣớc hạt lúa là một tính trạng tƣơng đối ổn định. Chiều dài hạt của các dòng dao động trong khoảng 7,74mm – 8,92mm, đƣợc sắp xếp theo thứ tự: R3.05 > R3.04 > R3.07 > R3.06 > KD; CR203 > R3.11; R3.16 > U17. Các dịng có nguồn gốc từ KD có chiều dài hạt tăng hơn so với đối chứng, dòng R3.04 tăng 0,41mm, dòng R3.05 tăng 0,68mm. Chiều dài hạt của dịng R3.11 có nguồn gốc từ CR203 thấp hơn so với đối chứng 0,40mm. Chiều dài hạt của dịng R3.16 có nguồn gốc từ U17 tăng so với đối chứng 0,41mm. Hệ số biến động về chiều dài hạt dao động trong khoảng 0,54% – 3,20%.

Chiều rộng hạt của các dòng chọn lọc và giống gốc dao động từ 0,63mm – 3,02mm. Các dịng có nguồn gốc từ KD đều có chiều rộng hạt tăng so với đối chứng, dòng R3.04 tăng 0,39mm so với đối chứng. Dịng R3.11 và R3.16 có chiều rộng hạt giảm so với đối chứng là 0,06mm và 0,08mm. Hệ số biến động chiều rộng hạt của các dòng chọn lọc dao động 1,58% (R3.11) – 4,5% (R3.04). Trong số 6 dịng chọn lọc có 4/6 dịng thuộc giống KD có hệ số biến động nhỏ hơn đối chứng. Các dịng thuộc giống CR203 và U17 có hệ số biến động lớn hơn đối chứng.

- Thời gian sinh trƣởng