Thành phần Hàm lƣợng (g, ml) K2HPO4 14 g KH2PO4 6 g Glucose 20 g (NH4)2SO4 6 g MgSO4.7H2O 0,2 g Vi lƣợng 2 ml Yeast extract 0,5 g Vi lƣợng: EDTA: 57,1 g/l ZnSO4.7H2O: 3,9 g/l CaCl2: 7 g/l MnCl2.3H2O: 5,1 g/l FeSO4.7H2O: 5,0 g/l
CuSO4.5H2O: 1,6 g/l CoCl2.5H2O: 1,6 g/l
Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn khử đạm đƣợc điều ch nh về pH 6 bằng HCl hoặc N OH, KOH.
3.2.3.2. Mơi trƣờng ni vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bảng 6: Thành phần 1 lít mơi trƣờng lỏng ni vi khuẩn tích lũy polyphosphate (Smolders et al., 1994)
Thành phần Hàm lƣợng (g, ml) Acetate 5 g Glucose 0,5 g Succinate 0,5 g CaCl2 NH4Cl KH2PO4 Pepton MgSO4.7H2O 0,005 g 0,02 g 0,088 g 0,5 g 0,01 g Stock 0,5 ml Yeast extract 0,5 g
Stock: dung dịch khoáng vi lƣợng bao g m: FeCl3.6H2O: 1,5 g/l H3BO3: 0,15 g/l CuSO4.5H2O: 0,03 g/l KI: 0,18 g/l MnCl2.4H2O: 0,12 g/l Na2MoO4.2H2O: 0,06 g/l ZnSO4.7H2O: 0,12 g/l CoCl2.6H2O: 0,15 g/l
Mơi trƣờng ni vi khuẩn tích lũy polyphosphate đƣợc điều ch nh về pH 7 bằng HCl hoặc N OH, KOH.
3.2.3.3. C c hó chất sử dụng để đo đạm
Dung dịch EDTA (C10H14N2O8Na2.2H2O - Ethylene diamine tetraacetic acid disodium salt) hòa tan 6g EDTA v i 100ml nƣ c khử kho ng.
Dung dịch phenol-sodium nitroprusside dehydrate: hòa tan 7g phenol (C6H5OH) và 0,034g sodium nitroprusside dehydrate (Na2Fe(CN)5NO.2H2O) thêm nƣ c đ 100ml, dung dịch này đƣợc bảo quản lạnh.
Dung dịch Sodium hypochloride: hò t n 4,98g Na2HPO4; 1,48g NaOH và 20ml NaClO thêm nƣ c đ 100ml.
Dung dịch đạm chuẩn N_NH4+
1 mg/l.
3.2.3.4. C c hó chất sử dụng để đo lân
Dung dịch A:
+ 70 ml acid sulfuric đậm đặc (H2SO4 đậm đặc) vào 500 ml nƣ c khử khoáng (1). + 6 gram ammonium molypdate (NH4)6Mo2O24.4H2O vào 25 ml nƣ c khử khoáng cho tan (2).
+ 0,1454 gram Potasssium antymonyl tartrate (KSbC4H4O6) vào 100 ml nƣ c khử khoáng (3).
+ Trộn (1), (2), (3) và thêm nƣ c cho đ 1 lít.
Dung dịch B: 200ml dung dịch A + 1,056g acid ascorbic. Dung dịch lân chuẩn P_P2O5 10 mg/l.
3.3. Phƣơng ph p nghiên cứu
3.3.1. Phƣơng ph p nuôi cấy vi khuẩn
Nuôi vi khuẩn khử đạm Pseudomonas stutzeri D3b và vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis DTT1.
Ni cấy làm đ ng đều giống:
Dùng que cấy chuyển khuẩn lạc đã ròng từ ống nghiệm thạch nghiêng đ ng đƣợc lƣu trữ trong t lạnh, cấy ri s ng ống nghiệm m i.
Nhân giống cấp 1:
Hút 1 ml nƣ c khử kho ng vô trùng cho vào ống nghiệm chứ vi khuẩn, lắc đều. Hút 100 l dịch huyền phù vi khuẩn cho vào bình t m gi c 250 ml chứ 100 ml
môi trƣờng nuôi cấy, tạo giống cấp 1.
Nhân giống cấp 2:
S u khi nhân giống cấp 1, tiến hành cấy chuyền tiếp s ng môi trƣờng m i, tạo giống cấp 2.
C c bình ni cấy vi khuẩn đƣợc đặt trên m y lắc, lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ 30oC. 3.3.2. Bố trí thí nghiệm 3.3.2.1. Thí nghiệm 1 Bảng 7: Bố trí thí nghiệm 1 Nghiệm thức Nƣ c r rác Sục khí Vi khuẩn (Pseudomonas stutzeri D3b + Bacillus subtilis DTT1) pH Ngu n dinh dƣỡng b sung
NT1 500 ml Có Khơng Khơng Khơng
NT2 500 ml Có 5%VK – 25 ml Không Không
NT3 500 ml Có 5%VK – 25 ml pH 6 Khơng
NT4 500 ml Có 5%VK – 25 ml pH 7 Không
NT5 500 ml Có 5%VK – 25 ml pH 8 Khơng
NT6 500 ml Có 5%VK – 25 ml pH 9 Không
NT7 500 ml Có 5%VK – 25 ml Không 5 g/l trisodium citrate dehydrate NT8 500 ml Có 5%VK – 25 ml Không 5 g/l glucose
NT9 475 ml Có 5%VK – 25 ml Khơng 5% (25 ml) nƣ c r r c NT10 450 ml Có 5%VK – 25 ml Không 10% (50 ml) nƣ c r r c
- Vi khuẩn đƣợc sử dụng v i t lệ 1:1 (vi khuẩn khử đạm Pseudomonas stutzeri
D3b: vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis DTT1).
- Nƣ c r r c sử dụng trong thí nghiệm này đƣợc lấy từ bãi r c Tân Long, xã Phụng Hiệp, t nh Hậu Gi ng. Lự chọn và rử kỹ thùng đựng mẫu, dùng t y cầm thùng nhúng vào khoảng giữ cống chứ nƣ c r r c ở bãi r c để lấy nƣ c r r c, đậy kín miệng thùng, ghi rõ ngày thu mẫu nƣ c r r c.
- Điều ch nh pH bằng cid cetic CH3COOH hoặc sodium hydroxide NaOH. - Ngu n dinh dƣỡng b sung vào nƣ c r r c: trisodium citrate dehydrate, glucose, acid acetic, nƣ c r r c trích từ thùng r c thải hữu cơ nhƣ r u c , đầu c , ruột c ,… đƣợc thu ở chợ Xuân Kh nh, Thành phố Cần Thơ.
Hình 3: Mơ hình thí nghiệm 1 (ngày 06/6/2012)
- Chuẩn bị 60 keo nhự có dung tích 1 lít:
+ 30 keo nhự có nắp đƣợc gắn v i h i sút-p p xe đạp (1 vịi sục khí, 1 vịi dẫn khí NH3) chứ nƣ c r r c, nắp đƣợc hàn kín lại v i thân keo nhự để tr nh thốt khí.
- + 30 keo nhự có nắp đƣợc đục 2 lỗ chứ 500 ml acid sulfuric 0,035 mol/l để nhận khí NH3 thốt ra từ keo nhự chứ 500 ml nƣ c r r c. Pha acid sulfuric 0,035 mol/l: 1000 ml nƣ c cất + 3,43 ml H2SO4 đậm đặc.
- Hệ thống đƣợc sục vịi sục khí nhỏ, khí từ m y sục khí đƣợc truyền vào keo chứ nƣ c r r c qu ống dẫn gắn. Khí NH3 tho t r đƣợc dẫn qu keo nhự chứ
- T ng lƣợng nƣ c r r c sử dụng cho thí nghiệm là 20 lít:
+ Bố trí vào 30 đơn vị thí nghiệm (500 ml/đơn vị [keo nhự có sút-páp xe đạp]) c 10 nghiệm thức.
+ Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp đều đƣợc thu khí NH3 thốt ra.
- Thí nghiệm đƣợc bố trí sục khí liên tục. Sau 12 giờ lấy mẫu để phân tích ch tiêu pH, NH4+ (NH4+ trong mẫu nƣ c r r c và NH4+ trong keo nhự chứ H2SO4 0,035 mol/l thu khí NH3), PO43- đến khi NH4+ không thay đ i.
- Phải đảm bảo tính đ ng đều ở c c nghiệm thức: hàm lƣợng khí sục vào, cùng chịu một điều kiện ngoại cảnh t c động, theo dõi trong suốt qu trình chạy mơ hình.
- C c mẫu phân tích phải đƣợc bảo quản trong t lạnh nếu chƣ phân tích ng y. Mục tiêu thí nghiệm: X c định ảnh hƣởng c pH, vi khuẩn khử đạm, vi khuẩn tích lũy polyphosph te, ngu n dinh dƣỡng đến hiệu suất loại bỏ ammonium và orthophosphate trong nƣ c r r c ở thể tích 500 ml.
Từ kết quả thí nghiệm 1, chọn r nghiệm thức tốt nhất thích hợp để tiến hành thí nghiệm 2 bố trí ở thể tích l n hơn (5 lít). 3.3.2.2. Thí nghiệm 2 Bảng 8: Bố trí thí nghiệm 2 Nghiệm thức Nƣ c r rác Sục khí Vi khuẩn (Pseudomonas stutzeri D3b + Bacillus subtilis DTT1) Ngu n dinh dƣỡng b sung NT1 5000 ml Có Khơng Khơng NT2 5000 ml Có 5% VK – 250 ml Khơng
NT3 5000 ml Có 5% VK – 250 ml 5 g/l trisodium citrate dehydrate NT4 5000 ml Có 5% VK – 250 ml 5 g/l glucose
NT5 4750 ml Có 5% VK – 250 ml 5% (250 ml) nƣ c r r c NT6 4500 ml Có 5% VK – 250 ml 10% (500 ml) nƣ c r r c
- Vi khuẩn đƣợc sử dụng v i t lệ 1:1 – vi khuẩn khử đạm Pseudomonas stutzeri D3b: vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis DTT1.
- Nƣ c r r c sử dụng trong thí nghiệm này là nƣ c r rác đƣợc lấy từ bãi rác Tân Long, xã Tân Long, huyện Phụng Hiệp, t nh Hậu Gi ng.
Hình 4: Mơ hình thí nghiệm xử lý nƣớc rỉ r c ở thể tích 5 lít (ngày 20/7/2012)
- Chuẩn bị 36 keo nhự dung tích 10 lít:
+ T ng lƣợng nƣ c r r c sử dụng cho thí nghiệm 2 là 90 lít bố trí vào 18 đơn vị thí nghiệm (5000 ml/đơn vị) c 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần.
+ Mỗi lần lặp c mỗi nghiệm thức đều đƣợc thu khí NH3 bằng bình chứ 5000 ml H2SO4 0,035 mol/l.
- C c đơn vị thí nghiệm đƣợc bố trí sục khí liên tục. - Lấy mẫu để phân tích ch tiêu pH, NH4
+
, NH3 (đƣợc thu trong keo nhự chứ H2SO4 0,035 mol/l), PO43- tại phòng Vi sinh vật đất, Viện Nghiên cứu và Ph t triển Công nghệ Sinh học. Thời gian theo dõi sau 24 giờ đến khi hàm lƣợng NH4+
không thay đ i.
- Lấy 1 lít mẫu nƣ c r r c đầu vào và đầu r để gửi mẫu phân tích ch tiêu COD, TSS, TKN, TP ở trung tâm Kỹ thuật và ng dụng Công nghệ Cần Thơ.
Mục tiêu thí nghiệm: x c định khả năng xử lý mmonium và orthophosph te trong nƣ c r r c c vi khuẩn và ngu n dinh dƣỡng thích hợp b sung vào nƣ c r r c
3.3.3. Phƣơng ph p phân tích c c chỉ tiêu hó lý 3.3.3.1. Đo pH (phƣơng ph p điện thế-m y đo pH)
Tiến hành theo dõi pH trong tất cả c c nghiệm thức mỗi ngày bằng m y đo pH. Mỗi nghiệm thức lấy khoảng 5 ml bằng c ch rót mẫu vào ly nhự (tr nh làm nhiễm c c mẫu v i nh u).
Rử sạch điện cực bằng bình ti chứ nƣ c cất, bật m y.
Hiệu ch nh pH về gi trị trung tính (pH = 7) bằng c c dung dịch pH chuẩn. Đặt điện cực c pH kế vào mẫu cần đo.
Đợi cho gi trị pH trên m y n định đọc kết quả.
S u mỗi lần đo phải rử điện cực thật sạch bằng nƣ c cất r i l u khô bằng giấy mềm, ngâm điện cực vào dung dịch bảo quản điện cực.
3.3.3.2. Đo đạm NH4+
(phƣơng ph p Indophenol Blue)
Tiến hành đo n ng độ mmonium tất cả c c nghiệm thức trong thí nghiệm mỗi ngày. X c định hàm lƣợng NH4+
trong môi trƣờng để đ nh gi khả năng khử đạm c c c ch ng vi khuẩn bằng c ch so màu trên m y qu ng ph kế Spectrophotomecter tại bƣ c sóng 636 nm, dự vào phƣơng ph p Indophenol Blue (Keeney Nelson, 1982).
Khí NH3 khi qu keo nhự chứ cid sulfuric 0,035 mol/l chuyển về dạng NH4+
nên hàm lƣợng NH3 đƣợc đo nhƣ hàm lƣợng NH4+có trong keo nhự chứ nƣ c r r c. Phƣơng ph p này đƣợc p dụng cho phân tích mẫu nƣ c thải v i độ cứng t ng cộng nhỏ hơn 400 mg/l và n ng độ nitrite nhỏ hơn 5 mg/l (Scheiner, 1976). Trong phƣơng ph p Indophenol, phenol và hypochlorite phản ứng trong môi trƣờng kiềm hình thành phenylquinone-monoimine, r i trở lại phản ứng v i mmonium tạo thành Indophenol có màu x nh, đƣợc minh họ qu phƣơng trình s u:
NH4+ + Phenol Hypochloride ion (môi trƣờng kiềm) Indophenol (có màu xanh)
Cƣờng độ màu tùy thuộc vào n ng độ hiện diện c mmonium và sodium nitroprusside đƣợc thêm vào để làm tăng cƣờng độ hiện màu trong dung dịch.
Các bƣớc tiến hành đo đạm NH4+:
Bƣ c 1: Dựng dãy đƣờng chuẩn (g m 6 ống nghiệm) hút lần lƣợt 2,5; 2; 1,5; 1; 0,5; 0 ml nƣ c cất cho vào 6 ống nghiệm đƣợc đ nh số từ 0 đến 5. S u đó, cho lần lƣợt 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 ml dung dịch đạm chuẩn có hàm lƣợng 1 mg/l vào ống nghiệm từ
0 đến 5. Thêm lần lƣợt 0,5 ml dung dịch EDTA, 1ml dung dịch phenol-sodium nitroprusside và 2 ml dung dịch sodium hypochloride vào mỗi ống, trộn đều dung dịch trên m y Vortex. Khi đó t đƣợc đƣờng chuẩn v i hàm lƣợng c c ống theo thứ tự tăng dần là 0, 1, 2, 3, 4, 5 mg/l NH4+.
Bƣ c 2: Hút 2 ml nƣ c cất và 0,5 ml dung dịch nƣ c r r c đã đƣợc ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ống nghiệm. Thêm lần lƣợt 0,5 ml dung dịch EDTA, 1ml dung dịch phenol-sodium nitroprusside và 2 ml dung dịch sodium hypochloride vào mỗi ống nghiệm, trộn đều dung dịch trên m y Vortex; để n định 15 – 20 phút ở nhiệt độ phòng.
Bƣ c 3: Bật m y qu ng ph khoảng 30 phút trƣ c khi đo, hàm lƣợng NH4+
đƣợc x c định bằng c ch đo cƣờng độ hấp thu màu (OD) ở bƣ c sóng 636 nm.
Đo gi trị OD ở 6 ống nghiệm đã biết hàm lƣợng NH4+
trƣ c, s u đó đo OD c c nghiệm thức. Sử dụng gi trị OD c ống nghiệm đƣờng chuẩn số 0 (khơng có NH4+
, khơng có màu x nh) làm mẫu bl nk đƣ gi trị OD về 0, tiến hành đo OD 5 ống nghiệm cịn lại. Đƣờng chuẩn lần lƣợt có hàm lƣợng NH4+
là 1, 2, 3, 4, 5 mg/l có màu x nh đậm dần sẽ tƣơng ứng v i 5 gi trị OD tăng dần. Bảng 9: Thành phần c dãy đƣờng chuẩn NH4+ Hó chất Ống 0 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5 Dung dịch N_NH4+ chuẩn (1 mg/l) 0 ml 0,5 ml 1 ml 1,5 ml 2 ml 2,5 ml Nƣ c cất 2,5 ml 2 ml 1,5 ml 1 ml 0,5 ml 0 ml EDTA 0,5ml Phenol-sodium nitroprusside 1ml Sodium hypochloride 2 ml Hàm lƣợng NH4+ mg/l 0 1 2 3 4 5
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để thiết lập phƣơng trình đƣờng chuẩn NH4+.
Dự vào phƣơng trình đƣờng chuẩn: A = *C + b Trong đó: C là hàm lƣợng đạm c mẫu (mg/l).
Dự vào độ hấp thụ qu ng c mẫu cần phân tích để tính hàm lƣợng NH4+
có trong mẫu nƣ c r r c theo công thức: C = (A – b)/a.
Hàm lƣợng NH3 đƣợc lấy mẫu và đo nhƣ đo hàm lƣợng NH4+ có trong mẫu nƣ c r r c (do NH3+ H+ NH4+).
Hình 5: Đƣờng chuẩn đo N_NH4+
(ngày 2/7/2012)
Ghi chú: 0 = 0 mg/l; 1 = 1 mg/l; 2 = 2 mg/l; 3 = 3 mg/l; 4 = 4 mg/l; 5 = 5mg/l
3.3.3.3. Đo lân (phƣơng ph p Acid scorbic) Các bƣớc tiến hành đo lân: Các bƣớc tiến hành đo lân:
Dựng dãy đƣờng chuẩn (g m 6 ống nghiệm), cho vào mỗi ống nghiệm 6 ml nƣ c cất. S u đó, hút lần lƣợt 2,5; 2; 1,5; 1; 0,5; 0 ml nƣ c cất cho vào 6 ống nghiệm đƣợc đ nh số từ 0 đến 5. Cho lần lƣợt 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 ml dung dịch lân chuẩn có hàm lƣợng 10 mg/l vào ống nghiệm từ 0 đến 5. Thêm 4ml dung dịch B vào mỗi ống nghiệm, trộn đều dung dịch trên m y Vortex. Khi đó t đƣợc đƣờng chuẩn v i hàm lƣợng c c ống theo thứ tự tăng dần là 0, 10, 20, 30, 40, 50 mg/l P_P2O5.
C ch đo mẫu nƣ c r r c: 8 ml nƣ c cất và 0,5 ml mẫu nƣ c thải. Thêm 4 ml dung dịch B vào mỗi ống nghiệm, trộn đều dung dịch trên m y Vortex.
Để n định 15 – 20 phút ở nhiệt độ phòng. Tiến hành đo hàm lƣợng P_P2O5 có trong mẫu dự trên phƣơng ph p so màu Oni ni ở bƣ c sóng 880 nm (OD880nm).
Đo gi trị OD ở 6 ống nghiệm đƣờng chuẩn, s u đó m i tiến hành đo OD c a các mẫu thí nghiệm.
Sử dụng gi trị OD c ống số 0 (khơng có P2O5, khơng có màu x nh) làm mẫu bl nk đƣ gi trị OD về 0, tiến hành đo gi trị OD c 5 ống đƣờng chuẩn cịn lại. Đƣờng chuẩn có màu x nh đậm dần sẽ tƣơng ứng v i gi trị OD tăng dần.
Bảng 10: Thành phần c dãy đƣờng chuẩn P_P2O5
Hó chất Ống 0 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5
Nƣ c cất 6ml
Dung dịch P_P2O5 chuẩn (10 mg/l) 0 ml 0,5 ml 1 ml 1,5 ml 2 ml 2,5 ml
Nƣ c cất 2,5 ml 2 ml 1,5 ml 1 ml 0,5 ml 0 ml
Dung dịch B 4 ml
Hàm lƣợng P_P2O5 mg/l 0 10 20 30 40 50
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel x c định phƣơng trình đƣờng chuẩn P_P2O5. - Phƣơng trình đƣờng chuẩn có dạng: Y = a*X + b
Trong đó: X là n ng độ c mẫu (mgY là độ hấp thụ qu ng (OD880nm)
Dự vào phƣơng trình đƣờng chuẩn P2O5 và gi trị OD880nm c mẫu để tính hàm lƣợng lân có trong mẫu tƣơng ứng v i lƣợng P_P2O5 theo công thức: X = (Y – b)/a
- Từ hàm lƣợng lân có trong mẫu tƣơng ứng v i hàm lƣợng P_P2O5, tính hàm lƣợng orthophosphate (PO43-
) dự theo cơng thức:
Trong đó X :hàm lƣợng lân có trong mẫu tƣơng ứng v i hàm lƣợng P_ P2O5. C: hàm lƣợng orthophosph te (PO43-) = 95 M PO = 146 4 P2O5 M = C X x M PO4 P2O5 M
Hình 6: Đƣờng chuẩn đo P_P2O5(ngày 2/7/2012)
Ghi chú: 0 = 0 mg/l; 1 = 10 mg/l; 2 = 20 mg/l; 3 = 30 mg/l; 4 = 40 mg/l; 5 = 50 mg/l
3.3.3.4. Chỉ tiêu COD (Chemical oxygen demand) – Nhu cầu oxy hó học
Phƣơng ph p li dicrom t (CODC r)
Nguyên tắc: Phƣơng ph p này dự trên khả năng oxy hó mạnh c k li dicrom t trong mơi trƣờng cid, sẽ oxy hó c c hợp chất hữu cơ trong nƣ c, lƣợng k li dicrom t tiêu tốn cho 1lít mẫu nƣ c đƣợc quy r lƣợng oxy (mg/l). Đun mẫu nƣ c thử v i thuốc