Hó chất Ống 0 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5
Nƣ c cất 6ml
Dung dịch P_P2O5 chuẩn (10 mg/l) 0 ml 0,5 ml 1 ml 1,5 ml 2 ml 2,5 ml
Nƣ c cất 2,5 ml 2 ml 1,5 ml 1 ml 0,5 ml 0 ml
Dung dịch B 4 ml
Hàm lƣợng P_P2O5 mg/l 0 10 20 30 40 50
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel x c định phƣơng trình đƣờng chuẩn P_P2O5. - Phƣơng trình đƣờng chuẩn có dạng: Y = a*X + b
Trong đó: X là n ng độ c mẫu (mgY là độ hấp thụ qu ng (OD880nm)
Dự vào phƣơng trình đƣờng chuẩn P2O5 và gi trị OD880nm c mẫu để tính hàm lƣợng lân có trong mẫu tƣơng ứng v i lƣợng P_P2O5 theo công thức: X = (Y – b)/a
- Từ hàm lƣợng lân có trong mẫu tƣơng ứng v i hàm lƣợng P_P2O5, tính hàm lƣợng orthophosphate (PO43-
) dự theo cơng thức:
Trong đó X :hàm lƣợng lân có trong mẫu tƣơng ứng v i hàm lƣợng P_ P2O5. C: hàm lƣợng orthophosph te (PO43-) = 95 M PO = 146 4 P2O5 M = C X x M PO4 P2O5 M
Hình 6: Đƣờng chuẩn đo P_P2O5(ngày 2/7/2012)
Ghi chú: 0 = 0 mg/l; 1 = 10 mg/l; 2 = 20 mg/l; 3 = 30 mg/l; 4 = 40 mg/l; 5 = 50 mg/l
3.3.3.4. Chỉ tiêu COD (Chemical oxygen demand) – Nhu cầu oxy hó học
Phƣơng ph p li dicrom t (CODC r)
Nguyên tắc: Phƣơng ph p này dự trên khả năng oxy hó mạnh c k li dicrom t trong mơi trƣờng cid, sẽ oxy hó c c hợp chất hữu cơ trong nƣ c, lƣợng k li dicrom t tiêu tốn cho 1lít mẫu nƣ c đƣợc quy r lƣợng oxy (mg/l). Đun mẫu nƣ c thử v i thuốc thử trong ống sinh hàn h i lƣu và chuẩn độ lƣợng dicrom t dƣ s u phản ứng v i dung dịch sắt (II) mmonium sulphate (NH4)2 Fe(SO4)2.6H2O. Ch số COD x c định theo phƣơng ph p này đƣợc ký hiệu là COD(Cr).
Cơ chế phản ứng:
- Trong môi trƣờng cid Cr2O72- th m gi phản ứng oxy ho c c hợp chất hữu cơ: Chất hữu cơ + K2Cr2O72- + H+ CO2 + H2O + 2Cr3+ + 2K+
- Lƣợng Cr2O72- còn dƣ s u phản ứng sẽ đƣợc x c định bằng dung dịch sắt (II) amonium sulphate
Cr2O72- + 6Fe2+ + 14H+ 2Cr3+ + 6Fe3+ + 7H2O
Dụng cụ: Bếp điện, ống sinh hàn h i lƣu, bình cầu h i c 250 ml, bình t m gi c 500 ml, ống chuẩn độ 25 ml và ống hút c c loại.
oá chất:
- Dung dịch k li dicrom t 0,25N: 12,259g K2Cr2O7 (sấy ở nhiệt độ 1050C trong 2 giờ) và hồ t n trong một ít nƣ c cất s u đó định mức thành 1000ml.
0 1 2 3 4 5
- Dung dịch sắt (II) ammonium sulphate 0,25N: 98 g (NH4)2 Fe(SO4)2.6H2O và hồ t n vào trong một ít nƣ c cất. Thêm 20ml H2SO4 đậm đặc s u đó định mức thành 1000ml.
- Chất ch thị feroin: 1,485 g 1-10 phenanthroline monohydrate, 695mg FeSO4.7H2O và hồ t n vào trong một ít nƣ c cất r i định mức thành 100ml.
- Acid sulfuric đậm đặc.
- Bạc sulphate (Ag2SO4) tinh thể. - Thuỷ ngân (II) tinh thể.
Cách tiến hành:
Lấy 50 ml mẫu nƣ c cần thử cho vào bình cầu 2 c dung tích 250 ml, thêm 20 ml dung dịch k li dicrom t 0,25N (khi lƣợng chất hữu cơ qu l n phải giảm b t thể tích mẫu nƣ c thử); thơng qu c bình cầu thêm từ từ từng lƣợng nhỏ 30 ml H2SO4 đậm đặc; thêm vào 1g Ag2SO4, cuối cùng cho vài viên đ bọt r i lắp ống sinh hàn h i lƣu, đun sôi nhẹ và giữ sôi trong 2 giờ.
Làm nguội bình, th o ống sinh hàn và dùng 25 ml nƣ c cất rử thành ống sinh hàn, chuyển dung dịch vào bình t m gi c dung tích 500 ml và tr ng bình cầu vài b lần bằng nƣ c cất.
S u đó thêm nƣ c cất vừ đ 250 ml, thêm 3 - 4 giọt chất ch thị màu feroin và dùng dung dịch sắt (II) ammonium sulph te 0,25 N chuẩn lƣợng k li dicrom t dƣ. Việc chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ màu x nh mực s ng đỏ nâu.
Tiến hành một thí nghiệm trắng v i 50 ml nƣ c cất và tiến hành tƣơng tự. Nếu trong mẫu cần phân tích có hàm lƣợng Cl-
cao thì cho thêm vào 1g Hg2+. Hàm lƣợng COD có trong mẫu nƣ c đƣợc tính theo cơng thức s u:
. .8.1000 V N b a X (mg/l) Trong đó:
- : Thể tích dung dịch sắt (II) mmonium sulphate dùng chuẩn mẫu trắng (ml) - b: Thể tích dung dịch sắt (II) mmonium sulphate dùng chuẩn mẫu phân tích
- N: N ng độ đƣơng lƣợng c dung dịch sắt (II) mmonium sulphate - V: Thể tích mẫu nƣ c đem thử (ml) - 8: Đƣơng lƣợng g m c oxy (g) 3.3.3.5. T ng đạm (TKN) và t ng lân (TP) Phƣơng ph p đo t ng đạm Nguyên tắc:
Khi đun mẫu vật có chứ nitơ trong H2SO4 đậm đặc v i chất xúc t c thích hợp thì tất cả c c hợp chất hữu cơ bị oxy ho , c rbon và hydro tạo thành CO2 và H2O. Nitơ phóng thích dƣ i dạng NH3 và kết hợp v i H2SO4 tạo thành muối (NH4)2SO4 tan trong dung dịch.
Hợp chất chứ nitơ (N) (NH4)2SO4
Chƣng cất, đu i nitơ r khỏi dung dịch (NH4)2SO4 dƣ i dạng NH3 bằng N OH, hấp thu NH3 bằng dung dịch cid boric (H3BO3) v i chất ch thị màu (hỗn hợp bromresol green và methyl red) tạo thành muối mmonium tetr bor t.
(NH4)2SO4 + 2N OH → N 2SO4 + 2NH3 + 2H2O 2NH3 + 4H3BO3 → (NH4)2B4O7 + 5H2O
S u đó định phân lƣợng nitơ trong dung dịch (NH4)2B4O7 bằng dung dịch cid mạnh H2SO4 0,05N (chuẩn) đến khi dung dịch chuyển từ màu x nh s ng màu đỏ nâu.
(NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O → (NH4)2SO4 + 4H3BO3 Hó chất:
Chất xúc t c vơ cơ hó mẫu: Nghiền mịn và trộn đều theo t lệ nhƣ s u: 100g K2SO4: 10g CuSO4: 1g Se
Hỗn hợp chất ch thị màu: Cân 0,099 bromoresol green và 0,666g methyl red hò tan trong 100 ml ethanol.
Dung dịch cid boric _ch thị màu: Cân 20g acid boric (H3BO3) hòa tan trong 950 ml nƣ c cất, s u đó cho 20 ml dung dịch chất ch thị màu khuấy đều, cho th m nƣ c cất vào cho vừ đ 1 lít (dung dịch có màu đỏ). Dung N OH 0,1N điều ch nh màu c dung dịch về màu đỏ nâu sắp chuyển s ng màu xanh (pH 5) (Bremner, 1970).
Dung dịch N OH 10N: Cân 400g N OH hò t n trong nƣ c cất cho vừ đ 1 lít chứ trong bình kín hạn chế tiếp xúc khí CO2.
Dung dịch H2SO4 0,05N.
Cách tiến hành:
Vô cơ ho mẫu
Cho vào bình kjeld hl lần lƣợt 0,5ml mẫu, 5ml H2SO4 đậm đặc, 0,5g chất xúc t c vô cơ ho . Tr ng bình kjeld hl một vịng bằng nƣ c cất, s u đó đem đun trong t hút độc đến khi dung dịch trong suốt h y có màu x nh lơ. Để nguội cho vào một ít nƣ c cất, dung dịch trong suốt h y có màu x nh lơ c CuSO4 thì mẫu đã bị vơ cơ ho hoàn toàn, nếu dung dịch có hạt màu đen thì t tiếp tục đun.
Song song v i mẫu thử thật t tiến hành mẫu thử không (th y lƣợng mẫu bằng lƣợng nƣ c cất) để loại trừ s i số.
Chƣng cất
Cho dung dịch đã vô cơ ho vào bình cầu c hệ thống chƣng cất đạm, tr ng bình kjeld hl 3 lần bằng nƣ c cất. Cho dung dịch N OH 10N vào bình cầu để trung hồ dung dịch vơ cơ ho đến khi dung dịch trong bình cầu chuyển từ trong suốt s ng màu x nh c CuSO4 và chuyển s ng màu x m.
Tiếp tục chƣng cất cho hơi nƣ c và NH3 tạo thành NH4OH vào cốc chứ 30ml dung dịch cid boric. S u đó hứng khoảng 100ml dung dịch có màu x nh nƣ c biển (thử bằng c ch dùng giấy quỳ: nếu nƣ c tụ từ ống sinh hàn làm giấy quỳ chuyển s ng màu x nh thì trong nƣ c còn lƣợng NH3 qu trình chƣng cất chƣ kết thúc, giấy quỳ không đ i màu chứng tỏ trong nƣ c khơng có NH3 qu trình chƣng cất kết thúc).
Định phân
Dung dịch s u khi chƣng cất đạm có màu x nh nƣ c biển đem chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0,05N đến khi dung dịch mất màu x nh và chuyển s ng màu đỏ nâu thì kết thúc, đọc số ml dung dịch H2SO4 0,05N sử dụng.
Tính kết quả
Nitơ t ng số (g/l) =
m
Trong đó:
V: Số ml H2SO4 0,05N dùng chuẩn độ mẫu.
V0: Số ml H2SO4 0,05N dùng chuẩn độ mẫu thử không. 0,0007: Số gr m nitơ tƣơng ứng v i 1ml H2SO4 0,05N.
m: Số ml mẫu (mẫu nƣ c) h y số gr m mẫu (mẫu khơ) đem phân tích. 1000: Hệ số quy đ i từ ml s ng lít h y từ gr m s ng kg.
Phƣơng ph p x c định phospho t ng Nguyên tắc :
Mẫu đƣợc vô cơ hó để chuyển c c dạng phospho về orthophosph te. Ammonium molybdate và potasssium antymonyl tartrate sẽ phản ứng v i orthophotph t để hình thành phức. Khử phức này bằng cid scorbic tạo thành phức molybden màu x nh. Đo màu tại bƣ c sóng 880nm.
Tiến hành :
Vơ cơ hó mẫu: Dùng hỗn hợp cid sulfuric và cid nitric
Lấy chính x c 50ml mẫu cho vào bình Kjeld hl. Thêm từ 1ml cid sulfuric (H2SO4) đậm dặc và 5ml cid nitric (HNO3) đậm đặc. Đun trên bếp đặc trong t hút t i khi xuất hiện khói trắng và đun tiếp cho t i khi dung dịch trong và không màu.
Làm nguội và thêm từ từ 20ml nƣ c cất, thêm 1 giọt ch thị phenolpht lein, thêm từ từ N OH 2N cho đến khi dung dịch có màu h ng nhạt. Chuyển mẫu và bình định mức 50ml, định mức đến vạch ( lọc nếu dung dịch bị đục hoặc có cặn).
Phân tích mẫu bằng phƣơng pháp acid ascorbic tại bƣ c sóng 880nm.
3.3.3.6. T ng chất rắn lơ lửng - TSS (Total Suspended Solid)
Thu mẫu vào bình 1 lít và đậy kín. Bảo quản lạnh 4o
C.
Lọc mẫu bằng giấy lọc có cấu tạo bằng chất liệu sợi th y tinh đƣờng kính 47 mm, cỡ lọc 0,22-0,45 µm.
Đ nh số mẫu trên giấy lọc. Sấy giấy lọc ở 105o
C trong 2-3 giờ. Cân và ghi khối lƣợng giấy lọc (Wo).
Lắc đều mẫu nƣ c trƣ c khi lọc. Lọc mẫu nƣ c, ghi thể tích mẫu nƣ c đã lọc (Vml).
Sấy ở 105o
C trong 2-3 giờ, hút ẩm 30 phút trong bình hút ẩm, cân khối lƣợng (W1).
C c ch tiêu về vật chất lơ lửng (TSS) đƣợc tính theo cơng thức s u:
1000 ) / ( 1 0 V W W L mg TSS V : thể tích mẫu nƣ c đã lọc (ml). W: khối lƣợng (mg).
3.3.4. Phƣơng ph p phân tích thống kê số liệu
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel xử lý số liệu và phân tích ANOVA để so s nh sự kh c biệt c c gi trị trung bình c c ch tiêu c nghiệm thức.
CHƢƠNG 4. ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1
4.1.1. Ảnh hƣởng c pH, vi khuẩn khử đạm, vi khuẩn tích lũy polyphosph te, trisodium citr te dehydr te, glucose và nƣớc rỉ r c đến pH c nƣớc rỉ r c
5 6 7 8 9 10
0 giờ 12 giờ 24 giờ 36 giờ
Thời điểm pH NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8 NT9 NT10
Hình 7: Ảnh hƣởng c pH, vi khuẩn khử đạm, vi khuẩn tích lũy polyphosphate, trisodium citr te dehydr te, glucose và nƣớc rỉ r c đến gi trị pH c nƣớc rỉ r c theo thời gi n
Ghi chú:
NT1 = Đối chứng
NT2 = Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri D3b + Bacillus subtilis DTT1 NT3 = Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri D3b + Bacillus subtilis DTT1 + pH 6 NT4 = Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri D3b + Bacillus subtilis DTT1 + pH 7 NT5 = Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri D3b + Bacillus subtilis DTT1 + pH 8 NT6 = Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri D3b + Bacillus subtilis DTT1 + pH 9
NT7 = Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri D3b + Bacillus subtilis DTT1 + 5 g/l trisodium citrate dehydrate NT8 = Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri D3b + Bacillus subtilis DTT1 + 5 g/l glucose
NT9 = Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri D3b + Bacillus subtilis DTT1 + 5 % nƣ c r r c NT10 = Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri D3b + Bacillus subtilis DTT1 + 10 % nƣ c r r c
Hình 7 cho thấy ch tiêu pH có sự th y đ i rõ rệt theo thời gi n trong c c nghiệm thức, pH c a nƣ c r r c tăng lên và n định ở pH 9,08 – 9,30 và khơng kh c biệt có ý nghĩ thống kê giữ c c nghiệm thức sau 36 giờ thí nghiệm.
Nghiệm thức vi khuẩn + pH 6 (NT3) và nghiệm thức vi khuẩn + pH 7 (NT4) có điều ch nh pH b n đầu về pH 6, 7 thì pH tăng mạnh đến 9, tuy nhiên khơng có sự kh c biệt có ý nghĩ thống kê giữ c c nghiệm thức.
Sử dụng KOH và acid acetic để tăng, giảm pH nƣ c r r c đầu vào đến gi trị 6, 7, 8, 9 nhằm tạo mơi trƣờng thích hợp cho quá trình ph t triển c vi sinh vật.
pH c c c nghiệm thức tăng có thể đƣợc giải thích bằng c c phản ứng xảy r nhƣ sau:
Sự phân h y c c hợp chất hữu cơ chứ nitơ tạo khí ammoniac (NH3) bởi c c vi sinh vật (Bitton, 2005) R – CH - COOH + O2 R-COOH + NH3 + CO2 (phản ứng 1) NH2 R – CH - COOH + 2H+ RCH3 + NH3 +CO2 (phản ứng 2) NH2 R – CH - COOH + H2O RCH2OH + NH3 +CO2 (phản ứng 3) NH2
NH3 lấy H+ trong nƣ c r r c làm giảm ion H+ trong nƣ c r r c: NH3 + H+ NH4+ (phản ứng 4)
Sự khử NO3-
và NO2- bởi vi sinh vật khử nitr te (Laobusnanant et al., 2009) 2NO2- + 6H+ + 6e- N2 + 2OH- + 2H2O (phản ứng 5)
2NO3- + 10H+ + 10e- N2 + 2OH- + 4H2O (phản ứng 6)
Phản ứng (1), (2), (3), (4) là sự phân huỷ c c chất hữu cơ chứ nitơ bởi hoạt động c c c vi sinh vật trong nƣ c r r c sinh r c c chất nhƣ NH3, CO2. Kết quả là giải phóng lƣợng ion NH4+
và làm tăng pH trong nƣ c r r c. Phản ứng (5) và (6) đƣợc thực hiện bởi vi khuẩn khử đạm cũng góp phần làm tăng tính kiềm, làm tăng gi trị pH trong nƣ c r r c.
Trong suốt qu trình thí nghiệm, pH c qu trình ln tăng thậm chí tăng đến gi trị trên 9. Điều này có thể do những nguyên nhân s u:
+ Một phần NH3 thốt ra do qu trình sục khí c mơ hình làm pH tăng. Sự biến đ i này có liên qu n đến hoạt động c c c vi sinh vật có sẵn trong nƣ c r r c và c c ch ng vi khuẩn khử đạm Pseudomonas stutzeri D3b, vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis DTT1 đƣợc b sung vào nƣ c r r c.
4.1.2. Ảnh hƣởng c pH, vi khuẩn khử đạm, vi khuẩn tích lũy polyphosph te, trisodium citr te dehydr te, glucose và nƣớc rỉ r c đến hàm lƣợng NH4+
(mg/l) c nƣớc rỉ r c 192,25c 121,6d 122,47d 129,55d 124,17d 102,08e 88,03e 91,83e 309,46b 482,27a 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 H à m l ƣợ n g N H4 (m g /l ) NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8 NT9 NT10 Nghiệm thức
Hình 8: Ảnh hƣởng c pH, vi khuẩn khử đạm, vi khuẩn tích lũy polyphosphate, trisodium citr te dehydr te, glucose và nƣớc rỉ r c đến hàm lƣợng NH4+ (mg/l) c nƣớc rỉ r c
* Những số theo s u trên cột cùng 1 chữ không kh c biệt ý nghĩ ở thống kê ở mức 1%. * Ghi chú:
NT1 = Đối chứng
NT2 = Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri D3b + Bacillus subtilis DTT1 NT3 = Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri D3b + Bacillus subtilis DTT1 + pH 6 NT4 = Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri D3b + Bacillus subtilis DTT1 + pH 7 NT5 = Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri D3b + Bacillus subtilis DTT1 + pH 8 NT6 = Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri D3b + Bacillus subtilis DTT1 + pH 9
NT7 = Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri D3b + Bacillus subtilis DTT1 + 5 g/l trisodium citrate dehydrate NT8 = Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri D3b + Bacillus subtilis DTT1 + 5 g/l glucose
NT9 = Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri D3b + Bacillus subtilis DTT1 + 5 % nƣ c r r c NT10 = Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri D3b + Bacillus subtilis DTT1 + 10 % nƣ c r r c
Hình 8 cho thấy hiệu quả oxy hó mmonium c c c nghiệm thức, trong đó, nghiệm thức vi khuẩn + trisodium citr te dehydr te (NT7) và nghiệm thức vi khuẩn + glucose (NT8) có hàm lƣợng mmonium (mg/l) thấp nhất s u qu trình thí nghiệm và khơng kh c biệt có ý nghĩ thống kê v i nh u.
Hàm lƣợng mmonium (NH4+) c nghiệm thức vi khuẩn (NT2), nghiệm thức vi khuẩn + pH 6 (NT3), nghiệm thức vi khuẩn + pH 7 (NT4) và nghiệm thức vi khuẩn + pH 8 (NT5) và nghiệm thức vi khuẩn + pH 9 (NT6) thấp hơn nghiệm thức đối chứng (NT1). Hàm lƣợng mmonium giảm so v i nghiệm thức đối chứng là do hoạt động có hiệu quả c vi khuẩn khử đạm Pseudomonas stutzeri D3b và vi khuẩn tích lũy