2. NGUYÊN L IU VẨ PH NG PHÁP NGHIÊN CU
2.3. Ni dung nghiên cu
Nơi dung nghiên c u và quy trình th c hi n kh o sát các nghi m th c đ c tĩm t t trong s đ hình 2.1.
Hình 2. 1 S đ n i dung nghiên c u
2.3.1 Xácăđnh thành ph n h p ch t cĩ ho t tính sinh h c 2.3.1.3. M căđíchănghiênăc u
Xác đnh thành ph n các h p ch t cĩ ho t tính sinh h c trong lá dâu t m đ đánh giá s b ch t l ng nguyên li u đ u vào, t đĩ tìm hi u s thay đ i v tính kháng oxy hĩa c a nguyên li u thay đ i d a trên các nghi m th c x lý vi sĩng cơng đo n sau.
2.3.1.4. Các ch tiêu phân tích
Các ch tiêu hƠm l ng h p ch t c a nguyên li u đ c ki m tra bao g m: Hàm l ng m.
Hàm l ng phenolic t ng.
Ho t tính kháng oxy hĩa theo ph ng pháp FRAP vƠ DPPH. Hàm l ng DNJ.
2.3.2 Nghiên c u thu nh n b t lá dâu t m ng d ngăph ngăphápăx lý s y vi sĩng các m c cơng su t khác nhau.
2.3.2.5. M căđíchănghiênăc u
Xác đ nh đ c ch đ vi sĩng phù h p đ đ t đ c hƠm m mong mu n (>10,5%, w/w) 2 m c cơng su t vi sĩng đ c kh o sát 500W vƠ 750W theo các m c th i gian dao đ ng trong kho ng 2-7 phút vƠ s nh h ng c a ch đ s y đ n hƠm l ng DNJ vƠ các h p ch t cĩ ho t tính sinh h c. T đĩ tìm ra ch đ s y cĩ th cho ra đ c lo i b t cĩ hƠm l ng DNJ cao nh t.
2.3.2.6. Quy trình thu nh n vƠăphơnătíchăđánhăgiá
Vì đ c tính d h h ng trong quá trình v n chuy n lá t i, t ng l ng lá s đ c chia làm 2 lo i đ th c hi n kh o sát quá trình s y b ng vi sĩng lƠ lá dơu khơ s b và lá t i, chi ti t s đ c mơ t ph n sau trong ti u m c này.
Di n gi i quy trình:
o Phân lo i: Lá dâu s đ c ch n l c b đi lá non, lá vƠng, lá b t n th ng v t lý và sâu b nh
o R a và làm ráo: Lá dâu t m đ c r a trong các thau nhơm đ lo i tr t p ch t c h c nh : cát, b i, và làm gi m l ng vi sinh v t bám vƠo trong lá c ng nh d l ng thu c b o v th c v t. Sau khi r a s ch lá đ c lƠm ráo đ khơng b úng trong quá trình b o qu n tr c khi x lý.
o Hong giĩ: Lá t i sau khi ráo n c s đ c làm khơ t nhiên b ng cách hong giĩ b ng qu t cho đ n khi đ t hàm m 52 ± 2%. Lá sau hong khơ đ c g i là lá dơu khơ s b
o S y vi sĩng: 2 lo i lá đ c c t thƠnh các s i cĩ đ r ng 1 cm và vi sĩng các m c th i gian 2, 3, 4, 5, 6 và 7 phút t i 2 m c cơng su t “Trung bình” (500W) vƠ “Trung bình cao” (750W). Sau khi k t thúc quá trình s y các m u đ c đ a vào bình hút m đ làm ngu i và ki m tra đ m. Các m u đ t đ m d i 10,5% và khơng cĩ hi n t ng lá b cháy đen ti p t c đ c ti p t c b c sang cơng đo n k ti p.
o Nghi n và rây: Các lá đ t yêu c u b c s y s đ c nghi n và rây qua 2 kích th c l i 60 mesh vƠ 70 mesh đ thu đ c b t lá dâu t m. B t lá dơu đ c b o qu n trong túi PE Zip lock 2 l p, l p ngồi ch a túi hút m đ tránh b t h p th đ m t mơi tr ng. Các m u đ c b o qu n t i nhi t đ -18oC cho đ n khi đ c phân tích.
2.3.3 Nghiên c u nhă h ng t l b sung b t lá dâu t mă đ n ch tăl ng
dinhăd ng và c m quan c a s t dâu t m.
Hình 2. 3 S đ quy trình n u s t dâu t m
Di n gi i quy trình:
o Phân lo i và r a: Sau khi qu đ c v n chuy n v , qu s đ c r a đ lo i b b i b n, cu ng lá và phân lo i theo màu s c, ngo i quan cĩ b d p hay sâu b nh khơng, sau khi hồn t t quá trình r a qu s đ c đ ráo n c.
o Xay nhuy n: Sau khi lƠm ráo n c, qu đ c cho vào máy xay sinh t và xay nhuy n thành d ng puree và tr n đ u gi a các m . sau đĩ đ c chia vào các h p nh a b o qu n.
o N u 85oC: Puree đ c pha lỗng v i n c và n u nhi t đ 85oC trong 20 phút đ vơ ho t các enzyme t nhiên cĩ trong qu . Khi quá trình n u đ t 15 phút, d u và gia v đ c cho ti p vào h n h p.
o Cơ c n 65oC: Sau khi k t thúc quá trình n u, b t lá đ c b sung ngay vào h n h p s t, sau đĩ, dùng máy đánh tr ng t c đ cao nh t (kho ng 1300 vịng/phút) đánh đ u h n h p đ đ m b o b t lá đ c phân b đ u trong s t. Khi 10% kh i l ng c a s t gi m xu ng ti p t c b sung xanthan gum vào
2.4. Cácăph ngăphápăphơnătích
2.4.1 Chu n b m u d ch trích phân tích
B t lá đ c trích ly trong dung mơi ethanol 50% (v/v) v i t l b t lá và dung mơi là 1:20 (w/v) trong b n siêu âm 30 phút kèm theo vi c l c đ u m i 5 phút. Sau khi trích ly siêu âm, ph n d ch trích đ c l c c n b ng gi y l c vƠ đnh m c th tích lên 50mL. Các m u dch trích đ c chia thành nhi u ph n và b o qu n t i t đơng sơu -20o
C cho đ n khi đ c s d ng.
2.4.2 PhơnătíchăhƠmăl ng phenolic t ng
HƠm l ng phenolic t ng đ c xác đnh s d ng ph ng pháp theo Yu và c ng s , 2018 đo đ h p thu s d ng ch t ch th Folin- Ciocalteu t i b c sĩng 760nm. Hàm l ng phenolic t ng đ c tính tốn s d ng đ ng chu n theo đ ng l ng mg Galic acid (mg GAE)/L d ch trích.
2.4.3 Phân tích hàmăl ng 1-Deoxynojirimycin
HƠm l ng 1-Deoxynojirimycin (DNJ) đ c xác đnh s d ng ph ng pháp đo đ h p thu quang h c c a DNJ theo nghiên c u c a Ling và c ng s (2016) t i b c sĩng 440nm, k t qu đ c thu đ c d a vƠo đ ng chu n s d ng 1-Deoxynojirimycin làm ch t chu n theo đ n v mg DNJ/mL d ch trích [21].
2.4.4 Kh n ngă c ch -glucosinase
Kh n ng c ch ho t tính enzyme -glucosinase đ c xác đ nh b ngj cách nh l ng l ng glucose t o thành t ph n ng gi a DNJ vƠ -glucosinase 37oC, 60 phút [22].
2.4.5 Kh n ngăkháng oxy hĩa 2.4.5.7. Ph ngăphápăDPPH
Kh n ng quét g c t do DPPH đ c đ gi m đ h p thu quang h c c a d ch trích t i b c sĩng 517nm đ c th c hi n theo ph ng pháp c a Molyneux và c ng s (2004) [23]. K t qu đ h p thu đ c phơn tích theo đ ng chu n c a Trolox v i đ n v là đ ng l ng µmol Trolox trên L d ch trích (µmol TE/L).
2.4.5.8. Ph ngăphápăFRAP
Kh n ng kh ph c Fe3+ -TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ)) thành ph c Fe2+ - TPTZ trong mơi tr ng acid đ c xác đ nh theo ph ng pháp đo đ h p th quang h c t i b c sĩng 593nm [24]. K t qu đ h p thu đ c phơn tích theo đ ng chu n c a Trolox v i đ n v lƠ đ ng l ng µmol Trolox trên lít d ch trích (µmol-TE/L).
2.4.6 Ch tiêuădinhăd ng c a thành ph m s t dâu t m
Thành ph n dinh d ng c a các m u s t dâu t m đ c g i phân tích t i Trung tâm cơng ngh Vi t c áp d ng các ph ng pháp t ng ng cho t ng ch tiêu theo b ng 2.3
B ng 2. 3 Ph ng pháp xác đ nh các ch tiêu thành ph n dinh d ng c a s t dâu theo
tiêu chu n Vi t Nam (TCVN)
STT Ch tiêu Ph ngăphápăs d ng 1 Hàm m TCVN 9741:2013 2 HƠm l ng lipid t ng TCVN 4331:1986 3 HƠm l ng protein t ng TCVN 8125:2015 4 HƠm l ng tro t ng TCVN 8124:2009 5 HƠm l ng đ ng t ng TCVN 4594:1988 6 HƠm l ng đ ng kh TCVN 4594:1988
2.4.7 ánhăgiáăc m quan
C 3 m u s t b sung l n l t 4, 6, 8% b t lá (w/wpuree) đ c đánh giá c m quan s d ng thang đánh giá Hedonic 9 đi m v i t ng c ng 70 ng i đánh giá.
2.4.8 Phân tích s li u
T t c các thí nghi m đ u đ c l p l i 3 l n. Giá tr đ c th hi n cĩ d ng: giá tr trung bình ± đ l ch chu n. so sánh s khác nhau gi a các k t qu , s li u đ c phân tích theo ph ng pháp phơn tích ph ng sai ANOVA. S li u đ c phân tích b ng ph n m m SPSS (ver 20.0) v i kho ng tin c y là 95%.
3. K T QU VÀ BÀN LU N
3.1. Thành ph n h p ch t cĩ ho t tính sinh h c trong lá dâu nguyên li uăđ u vào
B ng 3. 1 Hàm m và thành ph n ho t tính sinh h c c a lá dâu t i
STT Thành ph n nv K tqu
1 m % kh i l ng 75,211 ± 0,331
2 Hàm l ng phenolic t ng mg GAE/g ch t khơ 15,323 ± 0,211 3 Ho t tính kháng oxy hĩa
theo DPPH µmol TE/g ch t khơ 50,245 ± 5,532
4 Ho t tính kháng oxy hĩa
theo FRAP µmol TE/g ch t khơ 60 ± 0,549
5 Hàm l ng DNJ mg DNJ/g ch t khơ 2,300 ± 0,301
B ng 3.1 cho th y k t qu phân tích v hàm m và các thành ph n cĩ ho t tính sinh h c trong lá dơu t i tr c khi đ c kh o sát quá trình s y bao g m các ch tiêu và hàm l ng phenolic t ng, hƠm l ng DNJ và ho t tính c a các ch tiêu trong vi c kháng oxy hĩa theo 2 ph ng pháp DPPH vƠ FRAP. HƠm l ng v các h p ch t phenolic thu đ c trong lá dơu t i n m trong kho ng dao đ ng t 12,81 đ n 16,13 mg GAE/g ch t khơ phù h p v i các nghiên c u tr c đĩ v thành ph n cĩ kh n ng kháng oxy hĩa trong lá dâu t nhi u ch ng lo i dâu t m khác nhau nhi u khu v c nh Trung Qu c, n , Ý, Pháp, Tây Ban Nha [25, 26]. Tuy nhiên, ho t tính kháng oxy hĩa thu đ c l i khơng quá cao khi đ c đánh giá theo 2 ph ng pháp DPPH vƠ FRAP, nguyên nhân d n đ n hi n t ng này cĩ th do trong q trình trích ly phân tích các h p ch t phenolic xu t hi n vi c t o ph c v i các các đ i phân t ho c thành ph n khác trong lá dâu t m [27]. Nh ng d a trên s li u thu đ c v n t ng đ ng v i k t qu trong báo cáo c a S. Sarkhel và c ng s (2020) v ho t tính kháng oxy hĩa lá dơu đ c tr ng n (50,5µmol/g ch t khơ) [28]. HƠm l ng DNJ trong lá dâu thu đ c t ng đ ng v i báo cáo c a Hu và c ng s (2013) trong lá tr ng thành c a các gi ng dâu
t m và báo cáo c a Xue-Qin Hu và c ng s (2013) v hƠm l ng DNJ c a 58 gi ng M. alba L [29].
3.2. Thành ph n ho t tính sinh h c c a b t lá sau quá trình x lý nguyên li u 3.2.1 Kh o sát ch đ s y vi sĩng 3.2.1 Kh o sát ch đ s y vi sĩng B ng 3. 2 B ng t ng h p các nghi m th c cơng su t 500W, mã hi u và hàm m đ t yêu c u đ t ra STT Cơngăsu tăviăsĩng (W) Th iăgianăs y
(phút) Mưăhi uăm u HƠmă m
%(w/w) 1 500 3 DM3 10,44± 0,11 2 4 DM4 3,29 ± 0,13 3 5 FM5 10,20 ± 0,09 4 6 FM6 7,59 ± 0,10 B ng 3. 3 B ng t ng h p các nghi m th[30] c cơng su t 750W, mã hi u và hàm m đ t yêu c u đ t ra STT Cơngăsu tăviăsĩng (W) Th iăgianăs y
(phút) Mưăhi uăm u HƠmă m
%(w/w) 5 750 3 FAH3 10,50 ± 0,10 6 4 FAH4 8,00 ± 0,15 7 5 FAH5 5,87 ± 0,14
Sau quá trình th c hi n kh o sát ch đ s y cho 2 lo i lá v i hàm m 52 ± 2% (bán khơ-D) và 75% (t i -F) l n l t 2 m c cơng su t vi sĩng là 500W (M) và 7500 W (AH); th i gian s y đ c th c hi n l n l t 2, 3, 4, 5, 6, 7 phút. D a trên các ch đ kh o sát nêu trên và yêu c u v đ m d i 10,5% (w/w), khơng xu t hi n lá cháy, m c cơng su t 500W ch cĩ 4 m u đ t, trong đĩ cĩ 2 m u lá bán khơ và 2 m u lá t i;
Cịn m c cơng su t 750W, ch cĩ 3 m u đ t yêu c u và c 3 m u nƠy đ u s y t lá t i (đ m 75% w/w). (B ng 3.3).
D a vào k t qu thu đ c trong quá trình kh o sát vi sĩng t ng h p b ng 3.2 và b ng 3.3, khi so sánh v i ph ng pháp thơng th ng s y đ i l u b ng khơng khí nĩng (hình 3.1) thì cĩ th th y đ c là áp d ng vi sĩng mang l i hi u qu cao h n nhi u l n. Quá trình s y đ i l u c n 6.5, 4, 3 và 2 gi t ng ng l n l t v i các nhi t đ 40, 50, 60 và 70oC đ cĩ th h hàm m c a lá t i xu ng cịn kho ng 10%, trong khi đĩ, s y s d ng vi sĩng cơng su t 500W thì c đ nƠy đ c đ y nhanh lên g p 24 l n và 40 l n khi m c cơng su t 750W so sánh v i ch đ s y đ i l u nhi t đ 70oC. NgoƠi u đi m trong vi c đ y nhanh, rút ng n th i gian s y khi so sánh v i v i quá trình s y thơng d ng, ng d ng s y b ng vi sĩng cịn cho th y đ c các u đi m khác trong vi c h tr , t ng c ng kh n ng trích ly các h p ch t, thành ph n khác trong lá dâu t m, các u đi m này s đ c bàn lu n trong ph n sau c a báo cáo này.
Hình 3. 1 Bi u đ s thay đ i hàm m c a lá dâu t m trong quá trình s y đ i l u các
T b ng 3.2 và 3.3, các nghi m th c đ c ghi nh n đ t yêu c u v hàm m đ c ch n đ ti p t c ki m tra, phân tích các ch tiêu v hƠm l ng DNJ, hƠm l ng phenolic t ng và ho t tính ch ng oxy hĩa, t ng ng các cơng su t 500W là lá bán khơ vi sĩng 3 vƠ 4 phút; lá t i vi sĩng 5 vƠ 6 phút; cơng su t 750W ch cĩ lá t i đ c vi sĩng 3, 4 và 5 phút.
Hình 4.1 th hi n k t qu 1-Deoxynojirimycin (DNJ) thu đ c các nghi m th c s y vi sĩng c a 2 tr ng thái lá theo th i gian và cơng su t. K t qu cĩ th th y đ c m u lá đ c hong khơ s b sau th i gian x lý vi sĩng 4 phút m c cơng su t 500W thu đ c hƠm l ng DNJ cao nh t so v i các m u kh o sát, 6,580 ± 0.011 mg DNJ/gch t khơ Tuy nhiên, k t qu thu đ c l i khơng cĩ Ủ ngh a th ng kê khi l n l t so sánh v i các m u DM3, FM6, FAH3 vƠ FAH4, nh ng l i cĩ s khác bi t đáng k v i 2 m u lá t i đ c x lý vi sĩng 5 phút t i 2 m c cơng su t 500W và 750W l n l t t ng ng v i 5,431 ± 0,210 mg DNJ/gch t khơ, 4,711 ± 0,326 mg DNJ/gch t khơ.
D a vào s li u thu đ c, s y vi sĩng đư cho th y hi u qu trong vi c t ng c ng kh n ng trích ly DNJ ra kh i b t lá t ng t 2,04 đ n 2,86 l n, t ng ng v i m u DM4, hƠm l ng DNJ cao nh t, vƠ FAH5, hƠm l ng DNJ th p nh t. Cĩ th th y đ c xu h ng c a hƠm l ng DNJ đ c trích ly ra t ng d n theo th i gian x lý vi sĩng nh t ng 6,5% và 14,3% l n l t t ng ng v i mã hi u nghi m th c DM, FM. i v i d ab a bc