Ph l c A: Quy trình phân tích
B ng A- 1 Quy trình phân tích hàm l ng các h p ch t cĩ ho t tính sinh h c trong lá,
b t lá, s t dâu t m
Hĩaăch t Quy trình
Xácăđ nhăHƠmăl ngăPhenolicăt ng
75g Na2CO3 Gallic acid
Folin - Ciocalteu 10%
D ngăđ ngăchu n
Chu n b các dunjg d ch gallic acid chu n cĩ n ng đ (mg GAE/l): 10, 20, 30, 40, 50 t dung d ch chu n 100.
Cho 0,5 mL các dung d ch gallic acid vƠo ng nghi m
Cho 2,5 mL thu c th Folin - Ciocalteu vƠo, l c đ u.
Sau 4 phút, cho thêm 2 mL dung d ch Na2CO3 7,5%
t các ng nghi m vƠo b đi u nhi t 40oC trong 30 phút, tránh ánh sáng.
o đ h p thu b c sĩng 760 nm.
Pha loưng m u theo t l thích h p sao cho đ h p thu n m trong đ ng chu n. Các b c ti p theo th c hi n t ng t nh cách xơy d ng đ ng chu n nh ng thay dung d ch chu n gallic acid b ng m u d ch trích đư pha loưng.
M u tr ng: th c hi n t ng t nh ng thay m u d ch trích đư pha loưng b ng dung mơi trích ly.
Kh ăn ngăkhángăoxyăhĩaătheoăph ngăphápăDPPH
0,0118g DPPH + 500Ml methanol (đ h p thu 1,1±0,02)
Trolox
Cáchăd ngăđ ngăchu n
Pha loưng dung d ch chu n Trolox n ng đ 1000 µM thƠnh các dung d ch n ng đ 0, 250, 500, 750, 1000,
Cho 0,1 mL dung d ch Trolox các n ng đ vƠo ng nghi m.
Cho ti p 4 mL dung d ch DPPH vƠo ng nghi m, l c đ u, tránh sáng t i nhi t đ phịng trong th i gian 30 phút.
o đ h p thu t i b c sĩng 517 nm. D ng đ ng chu n n ng đ Trolox theo
đ h p thu v i tr c tung lƠ kh n ng quét g c t do (%) vƠ tr c hoƠnh lƠ n ng đ Trolox (µmol TE/L).
S d ng methanol lƠm m u tr ng.
Phânătíchăm uăd chătrích
Cho 0.1 mL m u đư pha loưng vƠo ng nghi m.
Cho ti p 4 mL dung d ch DPPH vƠo ng nghi m, l c đ u, tránh sáng t i nhi t đ phịng trong th i gian 30 phút.
o đ h p thu t i b c sĩng 517 nm. S d ng methanol lƠm m u tr ng.
Kh ăn ngăkhángăoxyăhĩaătheoăph ngăphápăFRAP Dungăd chăR1: m acetate 300 mM,
pH = 3,6. Cân 3,1 g CH3COONa.3H2O và hút 16 mL CH3COOH, đ nh m c lên 1 lít b ng n c c t (b o qu n 4o C). Dungăd chăR2: HCL 40 mM. nh m c 3,942 mL HCl 37% lên 1 lít
Cáchăd ngăđ ngăchu năTrolox
Pha loưng dung d ch chu n Trolox n ng đ 1000 µM thƠnh các dung d ch n ng đ 0, 250, 500, 750, 1000.
Cho 0,2 mL dung d ch Trolox các n ng đ vƠo ng nghi m.
b ng n c c t (b o qu n nhi t đ phịng).
Dungăd chăR3: TPTZ (2,4,6 -tri(2- pyridyl-s-triazine) 10 mM.
Cân 0,078 g TPTZ đ nh m c lên 25 mL b ng R2 (pha dùng trong ngƠy).
Dungăd chăR4: FeCl3.6H2O 20 mM.
Cân 0,540 FeCl3.6H2O đ nh m c lên 100 mL b ng n c c t (pha dùng trong ngƠy) Thu c th FRAP đ c chu n b b ng cách pha các dung d ch trên theo t l :
R1:R3:R4 = 10:1:1.
Dung d ch FRAP đ c gi t i nhi t đ phịng.
Dung d ch Trolox n ng đ chu n 1000 µM: Cân 0,025g Trolox vƠ đ nh m c lên 100mL b ng ethanol 99,5% thu đ c dung dch Trolox cĩ n ng đ 1000 µM.
đư pha trên vƠo m i ng. L c đ u, nhi t đ 37o
C, trong bĩng t i 4 phút.
o đ h p thu t i 593 nm.
D ng đ ng chu n n ng đ Trolox theo đ h p thu v i tr c tung lƠ n ng đ Trolox (µM) vƠ tr c hoƠnh lƠ đ h p thu.
Phơnătíchăm uăd chătrích
Cho 0,2 mL m u đư pha loưng vƠo ng nghi m.
Thêm 3,8 mL dung d ch thu c th FRAP đư pha vƠo ng nghi m, l c đ u
nhi t đ 37o
C, trong 4 phút.
o đ h p thu c a dung d ch sau ph n ng t i b c sĩng 593 nm.
M u tr ng: thay 0,2 mL m u d ch trích b ng 0,2 mL dung mơi trích ly.
Xácăđ nhăhƠmăl ngăDNJ
carbon disulfit đ ng sunfate 0.03M pirydine
Cáchăd ngăđ ngăchu năDNJ
Pha loưng dung d ch chu n DNJ n ng đ 1mg/mL thƠnh các dung d ch n ng đ 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625mg/mL.
Cho 0,1 mL dung d ch chu n vƠo ng nghi m.
Thêm 0,2mL carbon disulfide 0,2mL ethanol 99%
0,02mL pyridine
0,02mL dung d ch đ ng sulfate 0,03M l c đ u vƠ đ i cho tách l p
G n l y l p trên, đo đ h p thu 440nm D ng đ ng chu n n ng đ DNJ theo đ h p thu v i tr c tung lƠ n ng đ DNJ (mg/mL) vƠ tr c hoƠnh lƠ đ h p thu.
Phơnătíchăm uăd chătrích
nghi m.
Thêm 1mL carbon disulfide 1mL ethanol 99%
0,1mL pyridine
0,1mL dung d ch đ ng sulfate 0,03M l c đ u vƠ đ i cho tách l p
G n l y l p trên, đo đ h p thu 440nm M u tr ng: thay 0,5 mL m u d ch trích b ng 0,5 mL dung mơi trích ly.
Ho tătínhă căch ă - glucosidase
-glucosidase
m phosphate pH 6,8 pirydine
4-nitrophenyl-a-D-glucopyranoside 3mM
Phơnătíchăm uăd chătrích
Cho 0,2mL -glucosidase 0,5 U/ml và 0,2mL đ m phosphate pH 6,8 vƠo ng nghi m. Thêm 0,2mL m u vƠo. t i 37o C trong 15 phút Thêm 0,4mL 4-nitrophenyl-a-D- glucopyranoside 3mM vào
t i 37o C trong 10 phút D ng ph n ng b ng 3 mL Na2CO3 0,1M o đ h p thu t i b c sĩng 405nm M u đ i ch ng khơng thêm m u d ch trích M u tr ng khơng thêm c ch t
Ph l c B: ng chu n Hình B- 2 ng chu n hàm l ng phenolic t ng