D a trên nh ng so sánh trong B ng 1.3 ậ T ng h p m t s nghiên c u phân
tích đ ng th i NPX và ESP có th th y vi c phát tri năph ngăphápăđ phân tích đ ng th i NPX và ESP trong m uăd c ph m trong nh ngăn măquaăv n là m t h ngăđiăđ c quan tâm và ti p t c nghiên c u do tính ng d ng th c ti n c a nó trong quy trình ki m nghi măd c ph măđ m b o ch tăl ng thu căđ nătayăng i tiêu dùng là thu căđ t ch tăl ngăđãăcôngăb .
Tuy nhiên m iăph ngăphápăv n có nh ngă uănh căđi m khác nhau và s l ng nghiên c u cịn h n ch .ăDoăđóăđ đaăd ng hóa và có nhi uăph ngăphápăphùă h păh nătrongăvi c ng d ng ph ngăpháp ki m nghi m cho các doanh nghi p s n xu tăd căcóăđi u ki n thi t b ki m nghi m khác nhau hay n n m u khác nhau c n có thêm nhi u nghiên c u, vì v y trong nghiên c uănàyăh ngăđ n vi c m r ng thêm d li uăcácăph ngăphápăphânătíchăđ ng th i NPX và ESP, t iă uăhóaăđi u ki n phân tích và có th d dàng ng d ng trên các n n m u khác nhau.
21
1.8 T NG QUAN TH Mă NH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Th măđ nhăph ngăphápăphânătíchăđ đ m b oăph ng pháp phân tích phù h p v i các yêu c uăđãăđ căxácăđ nhătr c và luôn t o ra các k t qu phân tích tin c y.
Th măđ nhăph ngăphápăphânătíchăch ra cách ti năhànhăphânătích,ătrongăđóămơă t chi ti tăcácăb c c n thi tăđ th c hi n t ng phép th phân tích. Quy trình có th bao g m cách pha m u th , m u chu n và thu c th , cách s d ng thi t b , cách thi t l păđ ng chu n, s d ng cơng th căđ tính k t qu .
Tínhăt ngă thích h th ng đ c hi u Tính tuy n tính chính xác đúng
ng d ng quy trình phân tích trên m u th c
Ch năđi u ki n s c ký
Xây d ng quy trình x lý
Th măđnh quy trình phân Kh o sát c t s c ký Kh o sát pha đ ng Kh o sát b c sóng Kh o sát t c đ dòng Kh o sát th tích tiêm m u Tìm Tài li u tham Kh oăsátăđi u ki n s c kí Hình 1.14 S đ các b c th c hi n đ tài nghiên c u
22
Các ch tiêu c n th măđ nhăđ i v i m iăquyătrìnhătheoăh ng d n c a ICH đ c th hi n trong B ng 1.4 [30]: B ng 1.4. Các ch tiêu c n th m đ nh đ i v i m i quy trình Các yêu c u th m đ nh v i t ng lo i quy trình nh tính Xác đ nh t p ch t nh l ng - ăhòaătană - Hàmăl ng nhăl ng Th ăgi iăh n
Tínhăđ căhi uă(1) + + + +
ăchínhăxác ăl păl i - + - + ăchínhăxácă trung gian - + (2) - + Tínhătuy n tính - + - + ăđúng - + - +
Gi iăh năphátăhi nă(LOD) - - (3) + -
Gi iăh năđ nhăl ngă(LOQ) - + - -
Kho ngăxácăđ nh - + - +
D u (-): các ch tiêuănàyăthôngăth ng không c n ph iăđánhăgiá D u (+): các ch tiêu này c n ph iăđánhăgiá
(1): Quy trình kém đ c hi u có th b tr b ng các quy trình h tr khác (2):ă i v iăquyătrìnhăđ c áp d ngăđúngătheoăd căđi n thì khơng c n đánhăgiáăch tiêu này
(3): Có th c n trong m t s tr ng h p
23
Ki mătraătínhăt ngăthíchăh th ng là m t ph n không th tách r i trong nhi u ph ngăphápăphânătích.ă ánhăgiáătínhăthíchăh p c a h th ng là nh ng phép th nh măđánhăgiáătínhăthíchăh p c a tồn h th ngăphânătíchăđ c c u thành b i các y u t nh ămáyămócăthi t b , h th ngăđi n, cách ti n hành phân tích và m u th . Các thơng s c a phép th tínhăt ngăthíchăc a h th ngăđ c thi t l p cho t ng quy trình riêng bi t ph thu c vào lo iăquyătrìnhăđ c th măđnh.
Tính đ c hi u
Tínhăđ c hi u là kh n ngăđánh giá ch c ch n m t ch t phân tích khi có m t các thành ph n khác có th có trong m u th .ăThôngăth ng các thành ph n này g m các t p ch t, s n ph m phân hu , ch t n n... M tăquyătrìnhăphânătíchăkémăđ c hi u có th đ c b tr b ng m t ho c nhi u quy trình phân tích khác. nhăngh aănàyăcóă liênăquanăđ n các phép th sau:
nhătínhălàăđ kh ngăđ nh s có m t c a ch t phân tích..
Th tinh khi tălàăđ kh ngăđnh t t c các quy trình phân tích cho phép xác đ nhăchínhăxácăhàmăl ng t p ch t trong ch t phân tích ví d nh ăphépăth t p ch t liên quan, kim lo i n ng,ăhàmăl ng c a dung môi t năd ă...
nhăl ngă(hàmăl ng ho c ho t l c)ălàăđ aăraăk t qu chính xác v hàm l ng ho c ho t l c c a ch t phân tích trong m u th .
chính xác
chính xác c a m t quy trình phân tích di n t s th ng nh t (m căđ phân tán) k t qu gi a m t lo tăphépăđoăt nhi u l n l y m u trên cùng m t m u th đ ng nh t d i nh ngăđi u ki n mơ t . chính xác có th chia thành 3 c p:ăđ l p l i, đ chínhăxácătrungăgianăvàăđ tái l p. chínhăxácănênăđ c th trên m t m u th th c, đ ng nh t. Tuy nhiên, n u khơng có m uăđ ng nh t thì có th dùng m u t t o ho c m t dung d ch m u th . chínhăxácăth ngăđ c bi u th d i d ng đ dao đ ng,ăđ l ch chu n ho c h s đ daoăđ ng c a m t lo tăphépăđo.
24
l p l i di n t đ chính xác c a m tăquyătrìnhăphânătíchătrongăcùngăđi u ki n thí nghi m trong kho ng th i gian ng n. l p l iăcịnăđ c g iălàăđ chính xác trong cùng đi u ki năđ nhăl ng.
- Th c hi năxácăđ nh trên 6 m u th .ăTínhăhàmăl ngăd c ch t trong 6 m u th trên. T cácăhàmăl ngă(%)ăthuăđ c c a 6 m u,ătínhăđ l ch chu năt ngă đ i v iăđ tin c y P = 95 % theo công th c:
- Cơng th cătínhăđ l ch chu năt ngăđ i
x100 X SD RSD% 1 n X Xi SD 2
- Kho ng tin c y c a tr s trung bình ng v i P = 0,95 b c t do n-1:
n SD x t X
Xi: Là giá tr đoăđ c th i. : Là giá tr trung bình. n: S l năđo.
t: t (5;5%) = 2,015
Tínhăhàmăl ng so nhãn c a t ng d c ch t trong 6 m u th trên.
Cơng th c tính hàmăl ng NPX (C14H14O3) và ESP (C17H19N3O3S) có trong viên so v iăhàmăl ng ghi nhãn [28, 29]:
Pt (%) =
St Mc Dt Mtb Pc 100 N Mr1 Sc Mt Dc HLN 100 Mr2
Trong đó:
Pt (%) :ăHàmăl ngă(%)ăd c ch t có trong viên so v iăl ng ghi nhãn
St, Sc : Di nătíchăpicăd c ch t trên s căkỦăđ dung d ch th , dung d ch chu n Mc, Mt : Kh iăl ng cân m u chu n, th (mg)
25
Dt, Dc :ă pha loãng c a dung d ch th , dung d ch chu n (ml) Mtb : Kh iăl ng trung bình viên (mg)
Pc :ăHàmăl ng chu năd c ch t nguyên tr ng (%) HLN :ăHàmăl ngăd c ch t ghi nhãn (mg)
N : T l s molăquyăđ i
Mr1 : Kh iăl ng phân t d c ch t Mr2 : Kh iăl ng phân t ch t chu n
chính xác trung gian (Intermediate precision)
chính xác trung gian di n t m cădaoăđ ng c a k t qu trong cùng m t phịng thí nghi măđ c th c hi n các ngày khác nhau, ki m nghi m viên khác nhau và thi t b khác nhau.
tái l p (Reproducibility)
tái l p di n t đ chính xác gi a các phịng thí nghi m ( Các nghiên c u ph i h p gi a các phịng thí nghi măth ngăđ c áp d ngăđ tiêu chu năhoáăph ngă pháp).
Gi i h n phát hi n (Limit of Detection)
Gi i h n phát hi n c a m tăquyătrìnhăphânătíchălàăl ng nh nh t c a ch t phân tích trong m u th có th phát hi năđ cănh ngăkhơngănh t thi tăđ có th đnh l ngăđ c.
Gi i h n phát hi n có th đ căxácăđ nh d aăvàoăđ l ch chu n c aăđápă ngăvàăđ d c c aăph ngătrìnhăh i quy, giá tr LOD đ cătínhănh ăsau: LOD = 3,3 SD/ a
Trongăđó:
SD:ăđ l ch chu n c aăđápă ng m u tr ngăhayăđ l ch chu n c a đ ng h i quy
26
Khiăđãăxu t b ng d li u ANOVA (xem ph l c 0.11), ta tính LOD t các giá tr trong b ng d li uănh ăsau: LOD =3,3 (Standard Error/X variable 1)
Gi i h n đ nh l ng (Limit of Quantitation)
Gi i h năđ nhăl ng c a m tăquyătrìnhăphânătíchălàăl ng nh nh t c a ch t phân tích trong m u th đ có th đ nhăl ngăđ c v iăđ đúngăvàăđ chính xác thích h p. Gi i h năđ nhăl ng là m t thông s c aăphépăđ nhăl ng các ch t có n ngăđ th p trong m u th ,ăđ c bi tăth ngăđ cădùngăđ xácăđ nh t p ch t và/ho c s n ph m phân hu .
Gi i h n đ nhăl ng có th đ căxácăđnh d aăvàoăđ l ch chu n c aăđápă ngăvàăđ d c c aăph ngătrìnhăh i quy, giá tr LOQ đ cătínhănh ăsau: LOD = 10 SD/ a
Trongăđó:
SD:ăđ l ch chu n c aăđápă ng m u tr ngăhayăđ l ch chu n c a đ ng h i quy
a:ăđ d c c aăđ ng cong chu nă(đ ng tuy n tính) c aăph ngăpháp Khiăđãăxu t b ng d li u ANOVA (xem ph l c 0.11), ta tính LOD t các giá tr trong b ng d li uănh ăsau: LOD =10 (Standard Error/X variable 1)
Tính tuy n tính (Linearity)
Tính tuy n tính c a m t quy trình phân tích di n t k t qu phânătíchăthuăđ c t l v i n ngăđ (trong kho ng nh tăđ nh) c a ch t phân tích trong m u th .
Kho ng xác đnh (range)
Kho ng xác đnh c a m t quy trình phân tích là kho ng cách gi a n ngăđ trênăvàăd i c a ch t phân tích trong m u th (bao g m c các n ngăđ này), trong kho ng nông đ này, quy trình phân tích đã đ c ch ngăminhăđápă ngăđ chính xác, đ đúngăvàătínhătuy n tính.
27
đúngăc a m t quy trình phân tích bi u di n s đ ng nh t gi a giá tr tìm th y v i giá tr th c ho c giá tr đ i chi uăđ c ch p nh n. ôi khi khái ni m này còn g iălàăđ xác th c (trueness).
B ng 1.5 ậ Gi i h n ch p nh n các ch tiêu th măđnh xây d ng d a trên yêu c u c a t ng chuyên lu n c aă d c ch t theo USP 2022 ậ “Esomeprazole Magnesium delayed ậ releaseăcapsules”, “Naproxenădelayedăậ releaseătablets”ăvà h ng d n chung c a ICH [28, 29, 30].
B ng 1.5. Gi i h n ch p nh n các ch tiêu th m đnh.
CH TIÊU GI I H N CH P NH N
1.ăTínhăt ngăthíchăh th ng l ch chu năt ngăđ i H s kéoăđuôi phân gi i S đ aălỦăthuy t - RSD NPX ≤ă2,0ă% - RSD ESP 2,0 % - 0,8 ≤ Tf ≤ă1,5 - RNPX ậ ESP 1,5 - N 1000 2.ăTínhăđ c hi u
- Trên s că kỦă đ c a dung d ch th đ phân gi i c aăcácăpeakăchínhăvàătáăd c (n u có) ít nh t là 1,5.
- Trên s căkỦăđ c a dung d ch th : Các peak chính có cùng th iăgianăl uăv i các peak chính trên s că kỦă đ dung d ch chu n h n h p.
- Trên s căkỦăđ c a dung d ch chu n h n h p: Các peak chính có cùng th i gian l uăv i các peak chính trên s căkỦăđ
28
CH TIÊU GI I H N CH P NH N
dung d ch chu n riêng l .
- Trên s căkỦăđ dung d ch placebo 1 (ch g mătáăd c) khơng có peak trùng th i gianăl uăv i các peak chính trên s c ký đ c a dung d ch chu n h n h p.
- Trên s căkỦăđ dung d ch placebo 2 (tá d c ph i h p NPX) khơng có peak trùng th iăgianăl uăv i peak chính trên s căkỦăđ c a dung d ch chu n h n h p (tr peak NPX).
- Trên s căkỦăđ dung d ch placebo 3 (tá d c ph i h p ESP) khơng có peak trùng th iăgianăl uăv i peak chính trên s căkỦăđ c a dung d ch chu n h n h p (tr peak ESP). 3. Tính tuy n tính - 0,995 R2 1 4.ă chính xác - l p l i:ăRSDă(1)ă≤ă2,0% - chính xác trung gian: 質 RSDăă(KNV1)ă≤ă2,0%ă(n=6) 質 RSDă(KNV2)ăă≤ă2,0% (n=6) - RSDă(2KNV)ă≤ă2,0%ă(n=12) 5.ă đúng - T l ph c h i m i n ngăđ : 98,0% - 102,0% - RSDă≤ă2,0% 6. Kho ngăxácăđ nh - T 80% ậ 120%
29
CH NG 2: I T NG VÀ PH NG PHÁP NGHIểN C U
2.1 IăT NG NGHIÊN C U
2.1.1 iăt ng nghiên c u và nguyên li u
M u 1: M uăl uătheoădõiăđ năđ nhăhàmăl ng Naproxen ậ Esomeprazol là 375 ậ 20 mg, kh iăl ng 1 viên kho ng 550 mg.
M u 2: M uăl uătheoădõiăđ năđ nhăhàmăl ng Naproxen ậ Esomeprazol là 500 ậ 20 mg, kh iăl ng 1 viên kho ng 650 mg.
M u 3: M u viên nén ch a vi h tăcóăhàmăl ng Esomeprazole 20 mg, kh iăl ng 1 viên kho ng 313 mg.
M u 4: M u viên nén ch a vi h tăcóăhàmăl ng Esomeprazole 40 mg, kh iăl ng 1 viên kho ng 616 mg.
2.1.2 Dung mơi - Hố ch t:
B ng 2.1 Danh m c dung mơi – hóa ch t s d ng
Tên dung môi Nhà SX tinh khi t
N c c t CôngătyăCPăD c ph m SaVi 99,9%
Methanol Labscan 99,9%
Acetonitrile Labscan 99,9%
Ammonium acetate Merck 99,9%
Ammoniac Merck 99,9%
Sodium hydroxide Merck 99,9%
Mu i 1-Heptanesulfonate sodium (1-HSA) Sigma - Aldrich 98,0% Tetrabutylammonium hydroxide solution, 40 wt. % in H2O (TBH) Sigma - Aldrich 40% Chu n Naproxen VKN TTW 99,6% Chu n Esomeprazole magnesium VKN TTW 92,5%
30
2.1.3 Thi t b - D ng c
H th ng máy HPLC (Shimadzu) CTO ậ 40S, L22235801040 u dò UV SPD - 40
C t HPLC column Agilent Zorbax C8 5 m 4,6x150 mm RP8 Máy quang ph UV 1800 (Shimazdu)
Máyăn c c t 2 l n Cascada
MáyăđoăpH Mettler Toledo ậSV2110050027ăđãăhi u chu n ngày 08/10/21 Máy siêu âm
Máy ly tâm
Cân phân tích chính xácăđ n 0,1 mg QUINTIX224 ậ 1S
Màng l c nylon 0,45 m, d ng c thí nghi mă(Bìnhăđnh m c, pipet, ng đong,ălyăth y tinh...)
2.1.4 Chu n b hóa ch t ậ Ch t chu n
Dung d ch A: Cân 3,1 g Amonium acetat phaăloãngăđ n 1000 ml b ng n c c t,ăđi u ch nhăđ n pH = 10 b ng dd NH3. Tr n dd pH 10 v a pha v i MeOH theo t l 60:40 (v/v).
Dung d ch B: Cân 3,1 g Amonium acetat phaăloãngăđ n 1000 ml b ng n c c t,ăđi u ch nhăđ n pH = 7,6 b ng dd NH3. Tr n dd pH 7.6 v a pha v i MeOH theo t l 60:40 (v/v).
Dung d ch chu n NPX g c: Cân 100 mg chu năNPXăchoăvàoăbìnhăđnh m c 100 ml, thêm 70 ml dung dchăA,ăhịaătanăđ n tan hồn tồn, thêm dung d ch A v aăđ đ n v ch, l căđ u. L c qua màng l c nylon 0,45 µm (dung d ch chu n naproxen g c có n ng đ NPX kho ng 1,0 mg/ ml )
Dung d ch chu n EPS g c: Cân 20,7 mg chu n esomeprazole magnesium (t ngăđ ngă20ămgăesomeprazole),ăchoăvàoăbìnhăđnh m c 100 ml, thêm 10ămlămethanolăđ hịaătan,ăthêmămơiătr ng hịa tan v aăđ đ n v ch, l c đ u. L c qua màng l c nylon 0,45 µm (dung d ch chu n esomeprazole g c có n ng đ ESP kho ng 0,2 mg/ ml).
31
Dung d ch chu n: Hút chính xác 10,00 ml dung d ch chu n NPX g c và 5,0 ml dung d ch chu n EPS g căchoăvàoăbìnhăđnh m c 100 ml, thêm dung d ch B v aăđ đ n v ch, l căđ u. L c qua màng l c nylon 0,45 µm (dung d ch chu n có n ng đ NPX kho ng 0,1 mg/ ml và n ng đ ESP kho ng 0,01 mg/ ml).
m pH 7,6 (Không ch a tác nhân ion pair): Cân 3,1 g Amonium acetat phaăloãngăđ n 1000 ml b ng n c c t,ăđi u ch nhăđ n pH = 7,6 b ng dd NH3. m pH 7,6 (Ch a tác nhân ion pair 1-HSA): Cân 3,1 g Amonium acetat và
1,0 g mu i 1-Heptanesulfonate sodium phaăloãngăđ n 1000 ml b ng n c c t, đi u chnhăđ n pH = 7,6 b ng dd NH3.
m pH 7,6 (Ch a tác nhân ion pair TBH): ): Cân 3,1 g Amonium acetat và 2 ml dung d ch tetrabutylammonium hydroxide (TBH) 40% pha loãng đ n 1000 ml b ng n c c t,ăđi u ch nhăđ n pH = 7,6 b ng dd NH3.
m pH 7,6 (Ch a c hai tác nhân 1 – HSA và TBH): Cân 3,1 g Amonium acetat, 1,0 g mu i 1-Heptanesulfonate sodium và 2 ml dung d ch