Ấu trùng cảm nhiễm của tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng sau khi đã được tẩy trùng bề mặt bằng streptomycin 5000 đơn vị/ml (2-3 giờ) sẽ được chuyển vào đĩa Petri Φ 9mm (500 ấu trùng trong 1 ml nước cất) cùng với giấy thấm
Whatman # 1. Cho 5 ấu trùng bướm sáp lớn, Galleria mellonella vào đĩa, bọc lại bằng Parafilm để ngăn ngừa sự bốc hơi nước và bảo quản trong chỗ tối ở 25°C.
2.3.2 Phương pháp phân lập VKCS
Sau khi Galleria mellonella chết (24-48 giờ), tẩy trùng bề mặt xác của
Galleria bằng cách dìm vào cồn 96° trong vòng từ 1-2 phút, dùng 2 kẹp nhỏ,
khẽ xé rách lớp vỏ rồi dùng que cấy đã tiệt trùng lấy một chút dịch cơ thể
Galleria cấy lên đĩa môi trường NBTA. Bọc kín đĩa bằng parafilm và để trong
tủ ấm ở 300C, 24-48 giờ.
2.3.3. Phương pháp quan sát hình thái tế bào VKCS
Nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên phiến kính, dùng que cấy lấy vô trùng một khuẩn lạc VKCS và hoà trộn đều. Đặt lamen lên và quan sát hình dáng tế bào VKCS dưới kính hiển vi quang học.
2.3.4. Phương pháp định loại VKCS dựa trên trình tự 16S rDNA
2.3.4.1. Tách chiết DNA tổng số
Để tách DNA tổng số của VKCS, chúng tôi đã sử dụng DNeasy Blood and Tissue Kit của hãng QIAgen. Các bước tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất và được tóm tắt dưới đây:
Bước 1: Mẫu được chuyển vào ống eppendorf 1,5ml ly tâm loại dịch thu tế bào vi khuẩn.
Bước 2: Thêm 180µl dung dịch ATL, trộn đều, thêm 20µl dung dịch Proteinase K, trộn bằng Vortex, ủ ở 55ºC cho tan hết mẫu.
Bước 3: Trộn bằng Vortex khoảng 15 giây.
Bước 5: Chuyển toàn bộ dịch mẫu sang cột DNeasy Mini Spin (gọi tắt là cột) đặt trong ống thu dịch ly tâm (collection tube), ly tâm 8000 vòng /phút trong 1 phút.
Bước 6: Chuyển cột sang ống thu dịch ly tâm khác, thêm 500 µl buffer AW1, ly tâm 8000 vòng /phút trong 1 phút.
Bước 7: Chuyển cột sang ống thu dịch ly tâm khác, thêm 500 µl buffer AW2, ly tâm 14000 vòng/phút trong 3 phút. Bỏ dịch trong ống thu dịch ly tâm và ly tâm tiếp 14000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 8: Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml đã ghi kí hiệu mẫu, thêm 200
µl buffer AE, để ở nhiệt độ phòng 2 phút, ly tâm 8000 vòng /phút trong 1 phút. Bước 9: Bỏ cột, bảo quản DNA tổng số thu được trong ống eppendorf 1,5 ml ở -200 C.
2.3.4.2. Nhân đoạn DNA đích bằng kỹ thuật PCR
Đoạn gen 16S-rDNA được nhân bản (PCR) bằng các mồi theo mô tả của Brunel et al., 1997:
Mồi xuôi PXF: 5'-TCC TAC GGG AGG CAG CAG TG-3' Mồi ngược PXR: 5'-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3' Chuẩn bị hỗn hợp cho PCR với thành phần như sau:
Bảng 2.1: Thành phần hỗn hợp cho phản ứng PCR TT Thành phần Nồng độ Lượng (µl) 1 Taq PCR Mastermix 2X 12,5 2 Mồi xuôi 20 mM 1 3 Mồi ngược 20 mM 1 4 DNA tổng số 10 ng/µl 1 5 Nước cất khử ion - 9,5 Tổng 25
Căn cứ thông số kỹ thuật của mồi do nhà sản xuất cung cấp, chúng tôi đã thiết lập được chu trình nhiệt cho phản ứng như sau:
Bảng 2.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
Các giai đoạn PCR Nhiệt độ (o C) Thời gian (giây) Số chu kì
Biến tính ban đầu 96 120 1
Biến tính 96 30
35
Bắt cặp 50 30
Kéo dài 72 45
Kéo dài chu kỳ cuối 72 180 1
2.3.4.3. Điện di DNA trên gel agarose
- Đặt gel vào bể điện di, đổ dung dịch TBE 1X ngập mặt gel và nhẹ nhàng rút răng lược ra.
- Tra mẫu: mẫu DNA được trộn với dung dịch loading dye theo tỷ lệ 5:1 và tra mỗi mẫu vào một giếng điện di theo thứ tự mẫu.
- Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với hiệu điện thế 100V. Các phân tử DNA sẽ chạy từ cực âm sang cực dương.
- Gel sau khi chạy điện di được lấy ra và ngâm vào dung dịch Ethidium Bromide nồng độ 0,05 µg/ml trong khoảng 15 phút để nhuộm DNA. Băng DNA trong gel có thể nhìn thấy trên máy soi gel bằng tia tử ngoại có bước sóng 302 nm.
2.3.4.4. Tinh sạch sản phẩm PCR
Sử dụng bộ kit MinElute của hãng QIAgen để tinh sạch sản phẩm PCR. Các bước tinh sạch sản phẩm PCR theo hướng dẫn của nhà sản xuất kít và tóm tắt như sau:
Bước1: Chạy điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%.
Bước2: Cắt đoạn gel chứa băng DNA đặc hiệu của từng mẫu bằng dao nhỏ, sắc, sạch. Cho băng DNA đã cắt vào ống eppendorf 1,5 ml.
Bước 3: Cân đoạn gel từng mẫu đã cắt. Thêm 3 lần thể tích dung dịch QG theo trọng lượng từng mẫu (1g gel tương đương 1000 µl dung dịch QG).
Bước 4: Ủ ở 50ºC trong 10 phút cho tới khi gel tan hoàn toàn. Để làm tan gel tốt, lắc đều các ống eppendorf vài lần trong quá trình ủ, mỗi lần cách nhau 2 - 3 phút.
Bước 5: Khi gel đã tan hoàn toàn, kiểm tra màu của dung dịch mẫu. Màu của dung dịch tốt là màu vàng của QG ban đầu.
Bước 6: Hút toàn bộ dung dịch cho vào cột MinElute (gọi tắt là cột) đặt trong ống thu dịch ly tâm (collection tube) của Kit và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 7: Chuyển cột sang ống thu dịch ly tâm khác, cho 700µl dung dịch PE vào cột, để mẫu ở nhiệt độ phòng khoảng 5 phút, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 8: Chuyển cột sang ống thu dịch ly tâm khác và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 9: Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml đã ghi kí hiệu mẫu, cho 10µl EB vào cột và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 10: Bỏ cột, bảo quản sản phẩm PCR trong ống eppendorf ở ( - 200 C).
2.3.4.5. Xác định trình tự gen bằng máy tự động
Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng xác đinh trình tự DNA với thành phần như sau:
Bảng 2.3: Thành phần hỗn hợp phản ứng xác định trình tự DNA TT Thành phần Nồng độ Số lượng (µl) 1 Sản phẩm PCR 20 ng/µl 1 2 Mồi giải trình tự 1 mM 3 3 Dung dịch BigDye 2,5X 4 4 Nước cất khử ion - 2 Tổng 10
Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng xác định trình tự DNA
Biến tính ban đầu 96 60 1
Biến tính 96 10
25
Gắn mồi 50 5
Kéo dài 60 240
Giữ mẫu 4 Đến khi lấy mẫu 1
2.3.4.6. Tinh sạch sản phẩm để xác định trình tự:
Sản phẩm của phản ứng xác định trình tự được tinh sạch bằng phương pháp cột sephadex theo hướng dẫn của nhà sản xuất theo qui trình sau:
Bước 1: Cho cột sephadex vào ống thu dịch ly tâm 2 ml và ly tâm 3.000 vòng/phút trong 2 phút.
Bước 2: Chuyển cột sephadex sang ống eppendorf 1,5 ml.
Bước 3: Chuyển toàn bộ dung dịch của phản ứng giải trình tự của mỗi mẫu vào một cột sephadex và ly tâm 3.000 vòng/phút trong 2 phút.
Bước 4: Bỏ cột sephadex. Sấy khô dung dịch của phản ứng giải trình tự trong ống eppendorf bằng máy ly tâm chân không tại 1.500 vòng/phút trong 10 phút ở 450C.
Sản phẩm sau tinh sạch được đọc kết quả trên máy phân tích trình tự tự động ABI 3100 Avant Genetic Analyzer.
2.3.4.7. Phân tích dữ liệu
- Sử dụng chương trình BLAST để tìm kiếm các trình tự tương đồng đã được các tác giả khác công bố trên ngân hàng DNA (Genbank).
- Trình tự 16S-DNA của các chủng VKCS với Steinernema của VN được align với các loài Xenorhabdus khác trên Genbank (phụ lục I) bằng phần mềm
ClustalX 1.84.
- Phần mềm MEGA 4.0 (Tamura et al., 2007) được dùng để phân tích khoảng cách di truyền và xây dựng cây phát sinh chủng loại theo các phương pháp Maximum Parsimony (MP) (Eck & Dayhoff, 1966), Minimum Evolution (ME) (Rzhetsky & Nei,1992).
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN