- Thủy phân dịch lọc tinh bột:
o t (cp) Trng đó:
Trong đó:
µo : độ của nhớt của nước d1 : tỷ trọng của dịch thủy phân do : tỷ trọng của nước (do = 0,997) t1 : thời gian chảy của 2 ml dịch (giây) to : thời gian chảy của 2 ml nước (giây)
II.2.2.4. Phương pháp xác định hàm ẩm
Hàm ẩm của nguyên liệu được xác định bằng máy đo hàm ẩm Sartorius (Đức).
II.2.2.5. Phương pháp xác định hàm lượng chất khô tổng số
Hàm lượng chất khô tổng số được xác định bằng bằng chiết quang kế (Đức).
II.2.2.6. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử
(a). Với nguyên liệu chứa hàm lượng đường khử ≥ 50 g/l, sử dụng phương pháp Granxianop
▪Nguyên tắc: Đường khử khi đun nóng với dung dịch kiềm ferixyanua sẽ khử ferixyanua thành feroxyanua và đường khử chuyển thành axit đường. Dùng metyl
xanh làm chất chỉ thị sẽ mất màu xanh khi phản ứng kết thúc. Phản ứng chính như sau:
2K3Fe(CN)6 + 2KOH +CH2OH(CHOH)4CHO → 2K4Fe(CN)6 + 2 H2O + COOH(CHOH)4COOH ▪Dụng cụ: Bình tam giác, pipet, bếp điện
▪Hóa chất:
- Dung dịch ferixyanua kali 1%: 11g K3Fe(CN)6 hịa tan trong nước cất và định mức tới 1 lít.
- Dung dịch KOH 2,5N: cân 140 KOH hịa tan trong 1 lít nước cất - Dung dịch xanh metylen 0,5%
▪Tiến hành: Hút 20ml dung dịch ferixyanua kali cho vào bình tam giác 250ml, thêm vào đó 5ml dung dịch KOH 2,5N và 3- 4 giọt xanh metylen (nếu nồng độ dung dịch đường thấp hơn 0,25% thì lấy 10ml ferixyanua kali và 2,5 ml dung dịch KOH). Lắc nhẹ và đặt trên bếp điện hoặc bếp ga đun sôi. Chuẩn độ từ từ bằng mẫu cần xác định đường (dịch thủy phân), vừa chuẩn vừ lắc, đến khi dịch không đổi màu thì ngừng lại, xác định số ml mẫu đã dùng để chuẩn độ.
Cách tính lượng đường khử trong mẫu phân tích:
Đường khử = 0,025×1000× Hệ sơ ́ phaloãngV
mẫu
Trong đó:
0,025 : số g K3Fe(CN)6 ứng với 20ml K3Fe(CN)6 Vmẫu : thể tích mẫu dùng để chuản độ (ml)
(b). Với nguyên liệu chứa hàm lượng đường khử < 50 g/l, sử dụng phương pháp Nelson - Somogi
▪Nguyên tắc: Nguyên lý cơ bản của phương pháp này là đường khử bị oxy hóa bởi Cu2+ trong môi trường kiềm, sau đó Cu2O tạo ra sẽ khử phức chất arsenomolybdate để tạo thành sản phẩm có màu xanh. Lượng đường khử có trong dung dịch sẽ được xác định gián tiếp qua lượng phức tạo thành.
Phương trình phản ứng như sau:
CO32- + H2O HCO3 + OH- HCO3- + H2O H2CO3 + OH-
RCHO + Cu2+ + OH- RCOOH + Cu2O + H2O Cu2O + H2SO4 Cu2SO4 + H2O
2Cu+ + MoO42- Cu2+ + Molybdenum blue ▪Dung dịch chuẩn bị:
Dung dịch thuốc thử đồng (Somogy I):
(a) Hòa tan 24g Na2CO3 và12g Potassium tartrate vào trong 250 ml nước cất. Thêm 40 ml CuSO4.5H2O 10% và 16g NaHCO3.
(b) Hòa tan 180g Na2SO4 vào trong 500 ml nước cất.
Trộn lẫn dung dịch (a) & (b) và nâng đến thể tích 1 lít bằng bình định mức. Để ổn định mầu dung dịch này trong 1 tuần rồi lọc qua giấy lọc.
Dung dịch thuốc thử muối asenic molybden (Somogy II):
(a) Hòa tan 25g (NH4)6Mo7O24.4H2O vào trong 450 ml nước cất. Thêm 21 ml H2SO4.
(b) Hòa tan 3g Na2HAsO4.7H2O vào trong 25ml nước cất.
Trộn lẫn dung dịch (a) & (b) và nâng đến thể tích 1 lít bằng bình định mức. Để ổn định màu dung dịch này trong bình tối màu trong 2 ngày rồi lọc qua giấy lọc.
▪ Tiến hành:
- Lấy 1ml dịch pha lỗng ở nồng độ thích hợp
cho vào ống nghiệm. Bổ sung thêm 1ml Somogy I vào. Đậy kín sau đó đem đun sơi cách thuỷ trong vịng 10 phút. Lấy ra, làm nguội về nhiệt độ phòng. Bổ sung thêm 2ml Somogy II và để trong vòng 10 phút cho phản ứng tạo phức màu xảy ra hồn tồn sau đó lắc đều.
- Cho hỗn hợp dung dịch màu vào cuvet rồi đo mật độ quang của dung dịch tại bước sóng 500 nm.
Có thể sử dụng dung dịch đệm acetat 0,1M , pH 5,0 hoặc nước cất làm mẫu trắng.
Xây dựng đường chuẩn Glucose:
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn glucose 1 g/l
- Chuẩn bị dãy pha loãng: 0; 0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25; 0,30; 0,35; 0,40; 0,45 g/l Nồng độ
glucose (g/l) 0 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 OD(500nm) 0 0,197 0,364 0,484 0,594 0,695 0,872 0,949 1,147 1,218
Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn glucose theo phương pháp Nelson - Somogi
Đường chuẩn thu được có phương trình:
Từ giá trị OD thu được, dựa vào đường chuẩn và nồng độ pha lỗng có thể xác định được hàm lượng đường có trong mẫu phân tích:
x = [Glucose] (g/l) = y−0,05742,627 × D Trong đó: D là hệ số pha lỗng
II.2.2.7. Phương pháp xác định hàm lượng protein hòa tan
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Lowry.
▪ Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng màu của protein và thuốc thử Folin, cường độ màu của dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ protein, và dựa vào đường chuẩn của protein, có thể tính được hàm lượng protein của mẫu nghiên cứu.
▪ Hóa chất:
Thuốc thử A: 20g Na2CO3 được hịa tan trong 1 lít 0,1M NaOH.
Thuốc thử B : 0,5g CuSO4 và 1g potassium tartrate (2C4H4K2O6.H2O) được hòa tan trong 100ml nước cất.
Thuốc thử C: 50ml thuốc thử A và 1ml thuốc thử B trộn đều và dùng ngay.
Thuốc thử D: 1 thể tích thuốc thử phenol gốc và 1 thể tích nước cất 2 lần được hòa đều và cũng dung ngay.
▪ Cách tiến hành:
Cho vào ống phân tích 0,5ml dung dịch protein (0,005- 0,1%) và 5ml thuốc thử C được trộn đều và giữ yên ở 30°C trong 10 phút. Sau đó 0,5ml thuốc thử D được thêm vào hỗn hợp trên, trộn đều và giữ yên ở 30°C trong 20 phút. Đo OD của mẫu kiểm tra ở bước sóng 750nm. Nước cất sử dụng như mẫu trắng.
Xây dựng đường cong protein chuẩn:
Thuốc thử Albumin chuẩn được sử dụng như dung dịch protein. Ống albumin chuẩn 1g/l, được pha loãng ở các nồng độ từ 0,1- 0,9 g/l
Giá trị OD của dung dịch albumin với các nồng độ khác nhau ở 750 nm:
Albumin (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
OD (750 nm) 0
0,16 0,29
5
7 8 0 3 6 5 5 7
Hình 2.2. Đồ thị đường chuẩn Albumin theo phương pháp Lowry
Phương trình đường chuẩn thu được:
y = OD = 1,047x + 0,053 (R2 = 0,994) Hàm lượng protein (mg/ml) = x = y−0,0531,047 × Hệ số pha lỗng
II.2.2.8. Phương pháp xác định hàm lượng axit amin tự do (FAN)
Hàm lượng axit amin tự do được xác định bằng phương pháp Ninhydrin:
▪ Nguyên tắc: Phản ứng ninhydrin là phản ứng màu, dùng để định tính và định lượng axit amin, imino axit và amin. Khi đun nóng ninhydrin trong mơi trường kiềm với chất có nhóm chức amin bậc 1 sẽ thu được sản phẩm có màu tím xanh có maximum hấp thụ ở 570nm. Mật độ quang của sản phẩm thu được tuyến tính phụ thuộc vào số lượng nhóm amin tự do. Dựa vào tính chất này người ta có thể định tính được axit amin.
KH2PO4 : 60g
Ninhydrin : 5g
Fructoza : 3g
Dung dịch màu (1):
Hòa tan trong nước cất, định mức đến 1000 ml. Dung dịch màu này được bảo quản lạnh trong chai sẫm màu và có thời sử dụng trong 2 tuần.
Dung dịch pha lỗng (2): Hịa tan 2g KIO3 vào 600 ml nước cất và thêm cồn 96%V cho vừa đủ 1000ml.
▪ Cách tiến hành:
- Pha loãng mẫu tới nồng 1- 8mg α-amino nitrogen/lít (đối với dịch hèm thì pha lỗng 100 lần, đối với dịch bia thì pha lỗng 50 lần).
- Lấy 2ml mẫu đã pha loãng cho vào ống nghiệm và được đậy kín để tránh sự mất mát do bay hơi.
- Thêm vào 1 ml dung dịch màu (1), đun cách thủy trong nồi nước sơi 15 phút, sau đó làm nguội trong nước lạnh về 25°C .
- Cho vào ống nghiệm 5ml dung dịch pha loãng (2).
- Lắc đều và đo ở bước sóng hấp thụ tại 570nm (đo trong vòng 30 phút sau khi đã thêm dung dịch (2) vào).
- Mẫu trắng được chuẩn bị cùng với mẫu thí nghiệm ở trên, chỉ khác là thay 2ml dung dịch mẫu bằng 2ml nước cất.
Mẫu chuẩn: Hòa tan 107,2 mg glyxin trong 100ml nước cất. Dung dịch này
được bảo quản ở 0°C, mỗi lần thí nghiệm thì pha lỗng 100 lần. Dung dịch glyxin đã pha lỗng chứa 2 mg α-amino nitrogen/lít. Tiến hành các bước tương tự như đối với mẫu dịch hèm.
▪ Tính tốn:
Hàm lượng α- amino nitrogen (mg/l) được tính như sau:
FAN = A1×2× F
A₂
Trong đó:
A1 : Độ hấp thụ của dung dịch thí nghiệm (dung dịch mẫu)
A2 : Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn
F : Hệ số pha loãng
II.2.2.9. Phương pháp xác định hàm lượng cồn
Cồn được xác định bằng bộ cất cồn phịng thí nghiệm Salleron Dujardin (Pháp).Thiết bị này cho phép ta biết được độ cồn thu được trong dịch sau q trình lên men qua nhiệt độ sơi của dịch được quy đổi tương ứng trên bảng tra.
Các bước tiến hành:
Làm sạch bộ cất cồn bằng nước cất.
- Đo nhiệt độ sôi của nước cất để hiệu chỉnh trên bảng: nhiệt độ sôi của nước tương ứng với 0 độ cồn.
- Rửa lại bình cất bằng dung dịch mẫu sau đó cho 30ml mẫu vào bình chứa mẫu. Đun bằng đèn cồn và quan sát nhiệt độ sôi của dịch mẫu trên nhiệt kế.
- Tra trên bảng quy đổi từ nhiệt độ sôi của dịch mẫu ra độ cồn tương ứng.
II.2.2.10. Phương pháp xác định hàm lượng axit (a).Phương pháp xác định hàm lượng axit tổng số:
Axit tổng số của một dung dịch là một tiêu chuẩn để đánh giá tất cả những ion hydro (H+) của cả những axit dễ bay hơi và những axit khơng bay hơi có mặt trong dung dịch.
▪Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng trung hòa các axit có trong mẫu bằng dung dịch kiềm NaOH 0,1N với chỉ thị là phenolphthalein 0,1%. Từ lượng dịch kiềm tiêu
▪Cách tiến hành:
- Hút 20 ml dịch sau lên men vào bình tam giác 100 ml. - Nhỏ 1- 2 giọt phenolphthalein 0,1 % vào, lắc đều.
- Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N. Vừa chuẩn vừa lắc, đến khi dung dịch chuẩn sang màu hồng nhạt thì dừng lại.
▪Cách tính hàm lượng axit tổng trong dung dịch:
Những loại axit trong dung dịch được quy về một axit chung là axit lactic (C3H6O3)
C3H6O3 + NaOH → C3H5O3Na + H2O Lượng axit trong dịch sau lên men được tính theo cơng thức:
m (g/l) = K × VV NaOH
mẫu
Trong đó:
m : khối lượng của axit lactic (g/l).
K : hệ số quy đổi ra axit (với axit lactic K = 0,009; axit acetic K = 0,006 ; axit xitric K = 0,0064) . VNaOH : thể tích NaOH 0,1N đã dùng (ml).
Vmẫu : thể tích mẫu đã sử dụng (ml).
(b). Phương pháp xác định hàm lượng axit bay hơi:
Trong dịch sau lên men, ngoài những axit cố định, cịn có những axit dễ bay hơi. Những axit này cũng góp phần, quyết định đến chất lượng của rượu thành phẩm.
▪Nguyên tắc: Axit bay hơi được tách ra bằng phương pháp chưng cất cuốn theo hơi nước. Phần axit không bay hơi được xác định dựa trên phản ứng trung hòa
bằng dung dịch kiềm NaOH 0,1N với chỉ thị là phenolphthalein 0,1%. Lượng axít bay hơi được xác định bằng hiệu số giữa axit tổng và axit không bay hơi.
▪Cách tiến hành:
- Hút 20 ml dịch sau lên men vào bình tam giác 100ml.
- Đun cách thủy trong 10 phút để đuổi hết axit bay hơi.Làm nguội nhanh về nhiệt độ phịng.Định mức lại lượng axit thốt ra.
- Nhỏ 1- 2 giọt phenolphthalein 0,1%, lắc đều. - Chuẩn bằng dung dịch NaOH 0,1N.
▪Cách tính hàm lượng axit bay hơi trong dung dịch:
Lượng axit bay hơi (g) = Lượng axit tổng (g) - Lượng axit còn lại sau khi đuổi hết axit bay hơi (g).
II.2.2.11. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Hàm lượng polyphenol tổng số được xác định theo phương pháp Folin- Ciolcateau của Singleton:
▪Nguyên tắc: Oxy hóa tồn bộ lượng polyphenol trong rượu vang bằng dung dịch Folin-Ciolcateau (hỗn hợp axit phosphotungstic và axit phosphomolybdic). Các axit này sẽ bị khử thành các oxit vonfram (W8O23) và oxit molipden (M8O23) có màu xanh. Màu xanh này bị hấp thụ nhiều nhất ở bước sóng 770 nm và cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng polyphenol có trong mẫu.
▪Hóa chất:
-Dung dịch chuẩn axit gallic 0,5 g/l: Cân 0,1 g axit gallic, thêm 2 ml ethanol. Để nguội và định mức đến 20 ml để có dung dịch axit gallic 5 g/l. Hút 10 ml dung dịch axit gallic 5 g/l pha lỗng trong 90 ml nước để có dung dịch chuẩn axit gallic 0,5 g/l (Bảo quản dung dịch này ở 4°C trong vòng 2 tuần). Từ dung dịch chuẩn này, pha loãng với nước cất thành các dung dịch axit gallic có dải nồng độ từ 0- 120 mg/l.
- Dung dịch Na2CO3 20%. ▪Tiến hành:
- Hút 0,5ml mẫu và 3,95 ml nước cất vào ống nghiệm, thêm 0,25 ml dung dịch Folin Ciocalteu, lắc đều. Sau 5 phút (không được để quá 8 phút), thêm 0,75 ml dung dịch Na2CO3 20%, lắc đều. Để yên trong bóng tối, sau 30 phút tiến hành so màu ở bước sóng 770 nm.
- Dựng đường chuẩn polyphenol tổng số theo axit gallic:
Chuẩn bị dãy nồng độ axit gallic (mg/l): 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120. Axit gallic (mg/l) 0 20 40 60 80 100 120 Số µl nước cất 500 480 460 440 420 400 380 Số µl dung dịch axit gallic 0,5 g/l 0 20 40 60 80 100 120 OD (770 nm) 0 0,236 0,483 0,668 0,865 1,015 1,208
Hình 2.3.Đường chuẩn axit gallic theo phương pháp Singleton
▪ Cách tính kết quả: OD = y = 0,009x + 0,043 (R2 = 0,994)
▪ x = Hàm lượng polyphenol (mg/ml) = OD−0,0430,009 × Hệ số pha lỗng
II.2.2.12. Phương pháp xác định màu rượu
Độ hấp thụ màu của rượu Whisky được đo ở bước sóng 420 nm (ứng với độ hấp thụ màu nâu hoặc vàng, theo phương pháp của Mazza). Trước khi đo OD, mẫu rượu được lọc qua màng lọc 0,45 µm. Nếu màu đậm có thể pha lỗng trước khi so màu. Mẫu trắng là dung dịch ethanol 10%.
II.2.3. Phương pháp tính hiệu suất
▪ Hiệu suất chuyển hóa tinh bột thành đường (hiệu suất thủy phân) được tính dựa trên lượng đường tạo thành sau quá trình thủy phân so với lượng đường có trong ngun liệu.
▪ Hiệu suất lên men được tính dựa trên lượng cồn thực tế thu được so với lượng cồn tạo thành theo lý thuyết.
▪ Hiệu suất chưng cất được tính theo cơng thức: H (%) = VV2× N2
1× N1 × 100 Trong đó:
V1 : Thể tích rượu đưa vào chưng cất N1 : Nồng độ rượu đưa vào chưng cất V2 : Thể tích rượu thu được sau chưng cất N2 : nồng độ rượu thu được sau chưng cất
II.2.4. Phương pháp cảm quan [2,4]
II.2.4.1. Phương pháp cho điểm theo TCVN
Đánh giá chất lượng cảm quan rượu bằng phương pháp cho điểm theo TCVN 3217-79. Phương pháp này được sử dụng để đánh giá tổng quát mức chất lượng của sản phẩm so với tiêu chuẩn hoặc so với một sản phẩm cùng loại trên tất cả các chỉ tiêu cảm quan. Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng rượu theo phương pháp cảm quan và hệ số quan trọng cho từng chỉ tiêu như sau:
Bảng 2.1. Điểm tiêu chuẩn cho từng chỉ tiêu cảm quan của sản phẩm.
Tên chỉ tiêu
Điểm Yêu cầu sản phẩm
Độ trong và màu sắc
5 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục và vật thể nhỏ, mẫu hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm.
4 Chất lỏng trong suốt, khơng vẩn đục, có ít vật thể lạ nhỏ, màu đặc trưng cho sản phẩm.
3 Chất lỏng trong, có tương đối nhiều vật thể lạ nhỏ thô trầm trọng, màu khác nhiều so với màu đặc trưng của sản phẩm 2 Chất lỏng hơi đục, có khá nhiều vật thể lạ nhỏ thô trầm trọng,
màu khác nhiều so với màu đặc trưng của sản phẩm.
1 Chất lỏng đục nhiều lắng cặn, có nhiều vật thể lạ nhỏ thơ trầm trọng, màu khơng đặc trưng cho sản phẩm.
0 Vẩn đục, màu bẩn, sản phẩm bị hỏng.
Mùi
5 Hịa hợp, thơm dịu. Hồn tồn đặc trưng cho sản phẩm. 4 Chưa hồn tồn hịa hợp, thơm đặc trưng cho sản phẩm
nhưng hơi khó nhận mùi.
3 Hơi nồng, thoảng mùi phụ, ít đặc trưng cho sản phẩm. 2 Nồng, thoảng mùi lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm. 1 Nồng, hăng, mùi lạ rõ, không đặc trưng cho sản phẩm.