Kết quả thử độ chính xác cho thấy độ lệch chuẩn của các kết quả RSD =0,295 % < 2%. Vậy phơng pháp là chính xác.
2.2.4.2. Tính tuyến tính:
Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic trên chất chuẩn Berberin.
Cân 5 mẫu chất chuẩn Berberin clorid có khối lợng từ 0,1600g→ 0,2400g ( tại các điểm 80%,90%,100%,110%,120% nồng độ dùng khi định l- ợng)
Tiến hành tơng tự 2.2.3 Kết quả thu đợc ở bảng 6
Bảng 6: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ dung dịch
STT 1 2 3 4 5
C (μg/ml) 25,76 28,80 32,16 35,04 38,48
Diện tích pic (mAU.min)
9,7115 10,8580 12,1243 13,2081 14,5069
Hình 10: Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic vào nồng độ của dung dịch
- Phơng trình hồi quy về mối tơng quan giữa diện tích pic và nồng độ dung dịch là:y = 0,377x + 0,002
- Hệ số tơng quan: R = 0,9999
- Với độ tin cậy 95% ta có khoảng tin cậy của y_intercept: b 3,182S± b = 0,002 0,009 hay - 0,007 ± < y_intercept <0,011
Nhận xét: Hệ số tơng quan của đờng hồi quy vợt quá 0,99 Tất cả các…
giá trị đo đợc nằm trên đờng hồi quy hoặc phân bố đồng đều cả hai phía của đ- ờng hồi quy. Khoảng tin cậy của y_intercept chứa 0.
Vậy phơng pháp này là tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 80% đến 120% nồng độ làm việc.
2.2.4.3. Tính đúng:
. Cân 3 mẫu chất đối chiếu berberin clorid (hàm lợng 83,3%) với khối l- ợng từ 0,032g → 0,048g (tại các điểm 80%,100%,120% so với lợng cân dùng khi định lợng).
. Mỗi mẫu chạy sắc ký 3 lần, lấy giá trị trung bình. Tiến hành tơng tự 2.2.3
. Tính toán kết quả khảo sát tính đúng dựa trên diện tích pic của mẫu chuẩn là 12,2646 mAU.min ứng với khối lợng cân 0,0405 g.
Két quả thu đợc ghi ở bảng 7
Bảng 7: Kết quả khảo sát tính đúng của phơng pháp HPLC
STT Khối lợng cân(g) Lợng Beberin clorid có thực a (g) Diện tích pic trung bình (mAU.min) Lợng tìm lại trung bình b (g) Phần trăm tìm lại %=b/aì100% 1 0,0322 0,0268 9,8535 0,0270 100,75 2 0,0402 0,0335 12,1701 0,0334 99,70 3 0,0481 0,0401 14,5705 0,0400 99,75
Hình 11: Đồ thị biểu diễn phơng trình hồi quy tuyến tính về mối tơng quan giữa lợng hoạt chất có thực và lợng tìm lại
- Phơng trình hồi quy về mối tơng quan giữa lợng hoạt chất ban đầu và l- ợng hoạt chất tìm lại là: y = 0,997x + 0,001
- Hệ số tơng quan: R = 0,999 - Trung bình % tìm lại :100,07%
- Độ lệch chuẩn của y_intercept: Sb = 0,001 - Độ lệch chuẩn của độ dốc: Sa = 0,013 - Với độ tin cậy 95% ta có:
Khoảng tin cậy của độ dốc: a 3,182Sa hay 0,9560 < a <1,038 ±
Khoảng tin cậy của y_intercept :b 3,182S± b hay -0,002 < y_intercept <0,004
Kết luận :
- Không có sai số hệ thống hằng định vì khoảng tin cậy của y_intercept chứa 0.
- Không có sai số hệ thống tỷ lệ vì khoảng tin cậy của độ dốc chứa 1. - Giá trị trung bình của tỷ lệ thu lại là 100,07% nằm trong khoảng từ 98% đến 102%.
Nh vậy phơng pháp là đúng trong khoảng khảo sát.
2.2.4.4. Tính đặc hiệu:
Nh trong phần 1.1.2 đã trình bày, các tạp chất cần xác định trong Berberin nguyên liệu là Palmatin và Jatrorrhizin. Nhng trong điều kiện thí
nghiệm không có chất chuẩn Jatrorrhizin, chúng tôi chỉ tiến hành xác định sự ảnh hởng của tạp chất Palmatin đối với phơng pháp định lợng
Tiến hành:
. Cân 0,04 g berberin clorid chuẩn hòa tan trong nớc nóng, cho vào bình định mức 100 ml.Sau đó làm lạnh và thêm nớc tới vạch, thu đợc dung dịch Berberin clorid 0,4 mg/ml. Lọc qua màng lọc 0,45 μm, bỏ 8 ml dịch lọc đầu. Lấy chính xác 2 ml dịch lọc trên cho vào 4 bình định mức 25 ml , thêm nớc tới vạch.
. Pha dung dịch palmatin chuẩn có nồng độ 10%; 5%; 2,5% so với nồng độ berberin clorid đem chạy sắc ký.
+ Cân 0,04 g palmatin chuẩn hòa tan trong nớc nóng, cho vào bình định mức 100 ml, thêm nớc tới vạch. Lọc qua màng lọc 0,45 μm, bỏ 8 ml dịch lọc đầu. Lấy 5 ml dịch lọc này cho vào bình định mức 50 ml, thêm nớc tới vạch, thu đợc dung dịch palmatin 0,04mg/ml.
+ Lấy chính xác 25 ml dung dịch palmatin 0,04 mg/ml cho vào bình định mức 50 ml, thêm nớc tới vạch., thu đợc dung dịch palmatin 0,02 mg/ml.
+ Lấy chính xác 25 ml dung dịch palmatin 0,02 mg/ml cho vào bình định mức 50 ml, thêm nớc tới vạch, thu đợc dung dịch palmatin 0,01 mg/ml.
. Lần lợt thêm 2 ml dung dịch palmatin 0,04; 0,02; 0,01 mg/ml vào 3 bình định mức 25 ml trên, thêm nớc vừa đủ tới vạch. Bình định mức 25ml không thêm palmatin đợc thêm nớc vừa đủ tới vạch.
. Chạy sắc ký dung dịch 4 bình này. Kết quả thu đợc ghi trong bảng 8
Bảng 8: Kết quả thu đợc về sự ảnh hởng của tạp chất palmatin tới diện tích pic của Berberin clorid
Berberin clorid 0,4 mg/ml 2 2 2 2
Palmatin 0,04 mg/ml 2
Palmatin 0,02 mg/ml 2
Palmatin 0,01 mg/ml 2
Diện tích pic (mAU.min) 12,2650 12,3011 12,3229 12,2530
Hình 12: Sắc ký đồ mẫu trắng
Hình 13: Sắc ký đồ mẫu chuẩn
0.7 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 8.8 10.0 11.3 13.4-5.0 -5.0
35.0 KLLien #83 [modified by Administrator] BERBERIN TH10,4 UV_VIS_1 mAU min 1 - 4.653 2 - 7.420 WVL:263 nm Az
Hình 14: Sắc ký đồ mẫu chuẩn có thêm Palmatin
Nhận xét: Diện tích pic hầu nh không thay đổi khi có mặt tới 10% palmatin. Vậy phơng pháp có tính đặc hiệu khi có mặt của tạp chất này.
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.1-0.10 -0.10 1.0 ] UV_VIS_1 mAU min WVL:263 nm 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.1 -5.0
35.0mAU BERBERIN CH UV_VIS_1
min 1 - 7.353