STT Thành phần Khối lƣợng (g) Vai trò
24
2 PEG 400/TEC/DBP 1,5-15 Chất hóa dẻo, tăng độ
mềm dẻo, bám dính
3 Talc 3 Chống dính
4 TiO2 3 Chống dính, cản quang
5 EtOH 70% Vừa đủ 200 ml Dung môi
Tiến hành:
- Hòa tan Eudragit L100 vào khoảng 100ml dung dịch Ethanol 70% trong cốc có mỏ 200ml, sau đó thêm chất hóa dẻo, khuấy từ thu được dung dịch A.
- Nghiền mịn Talc và TiO2, trộn đều, rây qua rây 125. Sau đó tạo hỗn dịch đặc với 50-60 ml ethanol 70%.
- Phân tán hỗn dịch thu được vào dung dịch A, thêm ethanol 70% vừa đủ 200 ml, khuấy từ 1giờ và lọc hỗn dịch thu được qua rây 125.
- Duy trì khuấy trộn trong suốt quá trình bao.
Dự kiến các thông số kỹ thuật trong quá trình bao - Độ rung lắc: 10%
- Thổi gió: 55%
- Nhiệt độ buồng bao: 60oC
- Tốc độ phun dịch: 75%; 60 ml/giờ. - Áp suất khí phun: 0,5 bar.
Xác định sơ bộ độ tăng kích thước của màng bao bằng cách dừng máy bao đem cân lại khối lượng pellet cho đến khi đạt độ tăng kích thước màng bao khoảng 20%. Pellet bao được sấy trong tủ sấy ở 50o
C trong 15 phút, sau đó bảo quản ở điều kiện thường.
2.6. Phƣơng pháp đánh giá các đặc tính của pellet
Đánh giá hình thức
Quan sát bằng mắt thường về hình dạng và mức độ trịn đều của pellet, độ nhẵn trên bề mặt pellet.
Chụp SEM (kính hiển vi điện tử quét) để đánh giá đặc tính bề mặt bên ngồi và bề mặt cắt ngang của pellet.
Đánh giá khả năng tạo cầu và hiệu suất tạo cầu: Hiệu suất bào chế pellet (H) được tính theo cơng thức:
H (%) = x 100% Trong đó:
25 M: khối lượng bột nguyên liệu ban đầu (g). Đánh giá độ mài mòn của pellet nhân
Cân chính xác khoảng 20 g pellet nhân, sau đó sử dụng máy đo độ mài mòn Erweka và quay trong 4 phút với tốc độ 25 vòng/phút. Tiếp theo, lấy pellet ra và rây qua rây 250 để loại bột mịn rồi đem cân. Kết quả được tính theo cơng thức sau:
X = a-b
a 100 (%)
Trong đó : X là độ mài mịn của pellet (%). a là khối lượng pellet ban đầu (g).
b là khối lượng của pellet sau khi thử độ mài mòn (g). Định lượng
Mẫu thử được nghiền mịn, hòa tan trong methanol, đem lọc qua màng lọc 0,45µm, đem pha lỗng bằng methanol ở tỷ lệ nhất định để được nồng độ dung dịch thích hợp. Đem đi định lượng notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, Rb1, Rd và Re bằng phương pháp HPLC theo phương pháp mô tả trong mục 2.3.1.
Thử độ hòa tan in vitro
- Sử dụng máy thử độ hòa tan 708 DS Dissolution Apparatus với các thông số sau:
Thiết bị : cánh khuấy
Tốc độ : 100 vòng/ phút.
Mơi trường hịa tan : 900 ml dung dịch đệm phosphat pH 6,8. Nhiệt độ môi trường thử : 37 ± 0,5oC.
Mẫu : Lượng pellet tương ứng với 100 mg PNS
- Tiến hành:
Sau 30 và 60 phút, tiến hành hút 10 ml dung dịch trong bình, đem lọc qua màng lọc 0,45 µm và đồng thời thêm 10 ml đệm phosphat pH 6,8. Đem dịch lọc thu được pha lỗng bằng methanol tới nồng độ thích hợp, sau đó định lượng saponin tồn phần đã được hịa tan bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ tại bước sóng xác định. Mỗi mẫu thử tiến hành làm 3 lần và lấy kết quả trung bình.
Kết quả: nồng độ saponin toàn phần đã hiệu chỉnh ở lần hút thứ n được tính theo cơng thức như sau:
Cn = Cn0 + ∑ Ct
Trong đó:
26
Cn0: nồng độ saponin toàn phần định lượng được ở lần hút thứ n (µg/ml); Ct: nồng độ saponin tồn phần định lượng được ở lần hút thứ t (µg/ml); V0: thể tích dịch hịa tan đã hút (ml);
V: thể tích mơi trường hịa tan (ml).
Tính % saponin giải phóng trong mơi trường pH 6,8 trong 30 phút và 60 phút theo các công thức như sau:
Q30 = nồng độ saponin toàn phần đã hiệu chỉnh ở thời điểm 30 phút
nồng độ saponin theo lý thuyết (tính theo lượng saponin trong mẫu pellet thử) x 100%
Q60 = nồng độ saponin toàn phần đã hiệu chỉnh ở thời điểm 60 phút
nồng độ saponin theo lý thuyết (tính theo lượng saponin trong mẫu pellet thử)
u cầu: Khơng được ít hơn 80% saponin toàn phần giải phóng trong mơi trường đệm phosphat pH 6,8 sau thời gian 60 phút.
Pellet bao tan trong ruột được thử lần lượt trong 2 mơi trường hịa tan. Mơi trường hòa tan : 900 ml dung dịch đệm HCl pH 1,2,
900 ml dung dịch đệm phosphat pH 6,8.
Sau khi thử độ hoà tan của pellet bao tan ở ruột trong môi trường acid HCl pH 1,2 trong 2 giờ, tiến hành hút 10 ml dung dịch trong bình, sau đó lọc bỏ dịch acid trong bình thu lấy pellet, đưa vào tiếp tục thử hòa tan trong 900 ml dung dịch đệm phosphat pH 6,8 (tiến hành tương tự như thử hòa tan của pellet nhân). Dịch thử hịa tan trong mơi trường pH 1,2 đem lọc qua màng lọc 0,45 µm sau đó định lượng saponin toàn phần trong dịch lọc thu được.
Tính % saponin giải phóng trong mơi trường pH 1,2 trong 2 giờ và trong môi trường pH 6,8 trong 30 phút và 60 phút theo các công thức như sau:
C120 = nồng độ saponin toàn phần ở thời điểm 120 phút
nồng độ saponin theo lý thuyết (tính theo lượng saponin trong mẫu pellet thử) x 100% Yêu cầu :
- Khơng q 10% saponin tồn phần được hòa tan trong môi trường đệm HCl pH 1,2 trong 2 giờ.
Xác định độ trơn chảy
Sử dụng máy đo độ trơn chảy Erweka với đường kính lỗ phễu 10 mm. Tốc độ trơn chảy được tính theo cơng thức:
27 V = m
t Trong đó: V là tốc độ chảy của pellet (g/s).
m là khối lượng của pellet (g). t là thời gian chảy (s).
Thực hiện 3 lần để lấy kết quả trung bình. Xác định khối lượng riêng
Tiến hành trên máy đo khối lượng riêng biểu kiến Erweka. Cân chính xác một lượng pellet m(g) cho vào ống đong, đọc thể tích bột nguyên trạng Vt (ml), rồi rung đến thể tích không đổi không đổi Vbk(ml). Khối lượng riêng bột nguyên trạng và khối lượng riêng biểu kiến được xác định bằng các công thức:
Dt = m
Vt Dbk =
m Vbk
Trong đó Dt, Dbk là khối lượng riêng bột nguyên trạng và biểu kiến (g/ml). m là khối lượng pellet (g).
Vt, Vbk là thể tích bột nguyên trạng và biểu kiến (ml). Xác định độ tăng kích thước màng bao
Độ tăng kích thước màng bao tan ở ruột được xác định theo cơng thức: a = M-m
m ×100 (%) Trong đó: M là khối lượng pellet sau khi bao (g).
m là khối lượng pellet trước khi bao (g). a là độ tăng kích thước màng bao (%). Xác định hiệu suất bao
Sau khi bao, xác định lượng dịch bao đã sử dụng thực tế, rồi từ đó xác định lượng chất rắn trong dịch bao đã sử dụng. Xác định lượng dịch bao đã sử dụng thực tế bằng cách rây qua rây 250 (loại bỏ bụi) và rây 2500 (loại bỏ các hạt dính đơi, dính ba), cân lượng pellet thu được và tính được lượng dịch bao đã sử dụng (tính theo độ tăng kích thước màng bao).
Hiệu suất bao được tính theo cơng thức: H = a m
b ×100 (%) Trong đó : H là hiệu suất bao (%).
m là khối lượng pellet trước khi bao (g). a là độ tăng kích thước màng bao (%)
28
b là khối lượng chất rắn trong dịch bao đã sử dụng (g). Giản đồ nhiệt DSC
Mẫu hỗn hợp vật lý và mẫu pellet saponin tam thất (đã được nghiền mịn) được đánh giá đặc tính nhiệt theo phương pháp như đã mô tả trong mục 2.4.3.2.
Phổ nhiễu xạ tia X
Mẫu tá dược, hỗn hợp vật lý và mẫu pellet saponin tam thất (đã được nghiền mịn) được đánh giá phổ nhiễu xạ tia X theo phương pháp như đã mô tả trong mục 2.4.3.2.
2.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các kết quả thu được sẽ được xử lý thống kê với sự hỗ trợ của phần mềm Excel 2019 và được trình bày dưới dạng TB ± SD trong đó TB là giá trị trung bình, SD là độ lệch chuẩn.
29
CHƢƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu tiền công thức
3.1.1. Định lƣợng notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1,
ginsenosid Rd bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
3.1.1.1. Tính chọn lọc của phương pháp
Tiến hành sắc ký các dung dịch với điều kiện sắc ký như mục 2.4.1. Các sắc ký đồ (Hình 1 - PL1) cho thấy notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1, ginsenosid Rd được tách hoàn toàn trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn hỗn hợp 5 saponin và trong dung dịch mẫu thử. Thời gian lưu của pic notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1, ginsenosid Rd trên sắc ký đồ mẫu thử tương tự như thời gian lưu của các pic chuẩn ở các pic chuẩn riêng lẻ và có hệ số Rs lớn hơn 1,5 trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn hỗn hợp. Sắc ký đồ của mẫu trắng khơng có pic nào có thời gian lưu trùng với của các pic notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1, ginsenosid Rd.
3.1.1.2. Tính thích hợp của hệ thống
Tiến hành sắc ký 6 lần dung dịch chuẩn notoginsenosid R1 có nồng độ 50 µg/mL và ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1, ginsenosid Rd đều có nồng độ 160 µg/mL. Kết quả thể hiện trong bảng 1 - PL1. Độ lệch chuẩn tương đối RSD của diện tích pic và thời gian lưu của cả 5 mẫu chuẩn notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1, ginsenosid Rd đều dưới 2%.
3.1.1.3. Độ tuyến tính và khoảng nồng độ
Kết quả thể hiện trong bảng 2 – PL1. Trong khoảng nồng độ đã khảo sát của notoginsenosid R1 (12,5 - 100 µg/mL), ginsenosid Rg1 (12,5 - 200 µg/mL), ginsenosid Re (10 - 200 µg/mL), ginsenosid Rb1 (12,5 - 200 µg/mL), ginsenosid Rd (12,5 - 235 µg/mL) có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic với nồng độ đối với cả 5 saponin, với hệ số hồi quy tuyến tính r đều lớn hơn 0,995.
Kết luận: Phương pháp HPLC có tính chọn lọc, tính thích hợp cao và khoảng tuyến
tính rộng. Do vậy có thể ứng dụng phương pháp để định lượng notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1, ginsenosid Rd trong các mẫu nghiên cứu.
3.1.2. Kết quả xây dựng phƣơng pháp định lƣợng saponin toàn phần bằng phƣơng
pháp đo quang phổ UV-VIS
30
Quét phổ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn ở nồng độ đo quang 5,00 µg/ml (các bước tiến hành đã nêu ở mục 2.3.1) với dải bước sóng từ 400 đến 700 nm. Mẫu trắng là methanol làm phản ứng tương tự.
Kết quả: Dựa vào phổ hấp thụ quang thu được trên máy đo quang, xác định được đỉnh cực đại hấp thụ quang của saponin khi phản ứng với vanilin 5% trong acid acetic băng và acid percloric 72% ở bước sóng 550 nm.
Nhận xét: Kết quả này tương tự như trong các nghiên cứu khác về định lượng
saponin toàn phần trong tam thất [59], [70].
Kết luận: Chọn bước sóng 550 nm là bước sóng để xác định độ hấp thụ quang của
các mẫu chứa saponin tam thất.
3.1.2.2. Xây dựng đường chuẩn saponin tam thất
Đo độ hấp thụ quang của dãy dung dịch saponin tam thất chuẩn với các nồng độ dung dịch đo quang trong khoảng 3,00-7,00 μg/ml. Kết quả được thể hiện trong hình 2 - PL1.
Nhận xét: Giá trị R2 = 0,9967 > 0,995 cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát 3,00 – 7,00 μg/ml có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ saponin và độ hấp thụ quang. Do vậy, phương pháp đo quang có thể sử dụng để định lượng saponin tam thất trong các mẫu nghiên cứu.
Kết luận: Định lượng saponin toàn phần bằng phương pháp đo quang phổ UV –
VIS tại bước sóng 550 nm trong khoảng nồng độ 3,00 – 7,00 μg/ml.
3.1.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của tá dược tới độ hấp thụ quang của pellet saponin tam thất
Tiến hành làm phản ứng màu với các tá dược dự kiến trong thành phần pellet (cách tiến hành tương tự mục 2.3.1) và đo quang tại bước sóng 550nm. Kết quả thể hiện trong bảng 3 – PL1.
Nhận xét: Tại bước sóng 550nm, độ hấp thụ quang của các tá dược hầu hết đều <
2% so với độ hấp thụ quang của saponin tam thất. Lactose có độ hấp thụ quang tại bước sóng 550nm ở nồng độ 10μg/ml là khá cao (0,243).
Độ hấp thụ quang của thành phần tá dược (trừ lactose) hầu như không ảnh hưởng đến kết quả độ hấp thụ quang của các saponin tam thất. Các mẫu pellet chứa lactose sẽ được làm mẫu placebo để trừ nền.
Kết luận: Có thể dùng phương pháp định lượng saponin tam thất bằng phương pháp
đo quang phổ UV-VIS để định lượng saponin tam thất trong các mẫu pellet bào chế.
31
3.1.3.1. Định lượng 5 saponin notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1 và ginsenosid Rd trong cao khô saponin tam thất nguyên liệu
Tiến hành định lượng hàm lượng của 5 saponin trong cao khô saponin tam thất nguyên liệu theo phương pháp HPLC như đã mô tả trong mục 2.4.1.
Kết quả hàm lượng notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1, ginsenosid Rd trong cao khô saponin tam thất nguyên liệu bảng 4 - PL1.
Nhận xét: Theo Dược điển Trung Quốc 2015, tổng hàm lượng 5 saponin
notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1 và ginsenosid Rd khơng được ít hơn 75% khi dùng đường uống. Đối chiếu với kết quả về tổng hàm lượng 5 saponin này trong cao khơ saponin tồn phần thu được (80,39 %) cho thấy sơ bộ cao khô tam thất tinh chế đạt tiêu chuẩn về hàm lượng các saponin chính khi dùng đường uống.
3.1.3.2. Đặc tính vật lí
a. Một số đặc tính vật lí của cao khô tam thất nguyên liệu
Kết quả đánh giá đặc tính của cao khơ tam thất được thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Một số đặc tính vật lí của cao khơ saponin tam thất ngun liệu
STT Chỉ tiêu Kết quả
1 Cảm quan Dạng bột mịn màu trắng, hơi vàng nhạt
2 Phân bố kích thước Cao khơ saponin tam thất qua hết cỡ rây 0,125 mm
3 Hình ảnh SEM Hình 3 - PL1
4 Mất khối lượng do làm khô 4,59 ± 0,20%
5 Độ trơn chảy Chỉ số nén CI = 34,91 ± 0,91 6 Điểm nóng chảy 196,67 ± 2,03oC
Nhận xét:
- Cao khô saponin tam thất ở dạng bột rất mịn theo DĐVN V.
- Hình ảnh SEM cho thấy cao khơ saponin tam thất có hình dạng góc cạnh, bề mặt nhẵn. - Cao khơ saponin có kết quả mất khối lượng do làm khô thấp dưới 5%, đạt tiêu chuẩn
về mất khối lượng do làm khô cho cao khô theo DĐVN V
- Cao khơ saponin tam thất có giá trị CI cao (34,91), do vậy bột trơn chảy rất kém. Do vậy, để phân liều đồng đều, cần có các biện pháp cải thiện độ trơn chảy như tạo lớp phủ khô bằng các hạt nano silica 1% [85], tạo hạt, tạo pellet,…
- Điểm nóng chảy của saponin tam thất là 196,67o
C, nhiệt độ này cũng gần với pic điểm thu nhiệt ở giản đồ DSC. Nhiệt độ nóng chảy của cao khơ saponin tam thất nguyên liệu gần với kết quả nhiệt độ nóng chảy của ginsenosid Rb1 (197oC) và của ginsenosid Rg1
32
(194oC) trong nghiên cứu của Kim và cộng sự [32], điều này có thể do ginsenosid Rb1 và Rg1 chiếm tỉ lệ cao nhất (trên 60%) trong cao khô saponin tam thất.
b. Dạng thù hình ở trạng thái rắn
Phổ FTIR, giản đồ nhiệt DSC và phổ nhiễu xạ tia X
Kết quả phổ FTIR và giản đồ nhiệt DSC và phổ nhiễu xạ tia X của cao khô saponin tam thất được thể hiện trong hình 4, hình 5 và hình 6 - PL1.
Nhận xét: Cao khô saponin tam thất được đặc trưng bởi các dải sóng: 3228 cm-1
(các liên kết O-H), 2929 cm-1 (các liên kết C-H), 1252 cm-1, 1088 cm-1 và 1047 cm-1 (các liên kết C-O). Giản đồ nhiệt DSC của cao khô saponin tam thất có 01 điểm thu nhiệt ở 210,07oC, đây có thể là nhiệt độ nóng chảy của cao khơ saponin tam thất [35], [65], trong khi đó phổ nhiễu xạ tia X cũng khơng có các đỉnh nhiễu xạ đặc trưng. Từ những kết quả này cho thấy cao khô saponin tam thất tồn tại ở trạng thái vơ định hình.