3.1. Kết quả nghiên cứu tiền công thức
3.1.1. Định lƣợng notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1,
ginsenosid Rd bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
3.1.1.1. Tính chọn lọc của phương pháp
Tiến hành sắc ký các dung dịch với điều kiện sắc ký như mục 2.4.1. Các sắc ký đồ (Hình 1 - PL1) cho thấy notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1, ginsenosid Rd được tách hoàn toàn trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn hỗn hợp 5 saponin và trong dung dịch mẫu thử. Thời gian lưu của pic notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1, ginsenosid Rd trên sắc ký đồ mẫu thử tương tự như thời gian lưu của các pic chuẩn ở các pic chuẩn riêng lẻ và có hệ số Rs lớn hơn 1,5 trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn hỗn hợp. Sắc ký đồ của mẫu trắng khơng có pic nào có thời gian lưu trùng với của các pic notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1, ginsenosid Rd.
3.1.1.2. Tính thích hợp của hệ thống
Tiến hành sắc ký 6 lần dung dịch chuẩn notoginsenosid R1 có nồng độ 50 µg/mL và ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1, ginsenosid Rd đều có nồng độ 160 µg/mL. Kết quả thể hiện trong bảng 1 - PL1. Độ lệch chuẩn tương đối RSD của diện tích pic và thời gian lưu của cả 5 mẫu chuẩn notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1, ginsenosid Rd đều dưới 2%.
3.1.1.3. Độ tuyến tính và khoảng nồng độ
Kết quả thể hiện trong bảng 2 – PL1. Trong khoảng nồng độ đã khảo sát của notoginsenosid R1 (12,5 - 100 µg/mL), ginsenosid Rg1 (12,5 - 200 µg/mL), ginsenosid Re (10 - 200 µg/mL), ginsenosid Rb1 (12,5 - 200 µg/mL), ginsenosid Rd (12,5 - 235 µg/mL) có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic với nồng độ đối với cả 5 saponin, với hệ số hồi quy tuyến tính r đều lớn hơn 0,995.
Kết luận: Phương pháp HPLC có tính chọn lọc, tính thích hợp cao và khoảng tuyến
tính rộng. Do vậy có thể ứng dụng phương pháp để định lượng notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1, ginsenosid Rd trong các mẫu nghiên cứu.
3.1.2. Kết quả xây dựng phƣơng pháp định lƣợng saponin toàn phần bằng phƣơng
pháp đo quang phổ UV-VIS
30
Quét phổ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn ở nồng độ đo quang 5,00 µg/ml (các bước tiến hành đã nêu ở mục 2.3.1) với dải bước sóng từ 400 đến 700 nm. Mẫu trắng là methanol làm phản ứng tương tự.
Kết quả: Dựa vào phổ hấp thụ quang thu được trên máy đo quang, xác định được đỉnh cực đại hấp thụ quang của saponin khi phản ứng với vanilin 5% trong acid acetic băng và acid percloric 72% ở bước sóng 550 nm.
Nhận xét: Kết quả này tương tự như trong các nghiên cứu khác về định lượng
saponin toàn phần trong tam thất [59], [70].
Kết luận: Chọn bước sóng 550 nm là bước sóng để xác định độ hấp thụ quang của
các mẫu chứa saponin tam thất.
3.1.2.2. Xây dựng đường chuẩn saponin tam thất
Đo độ hấp thụ quang của dãy dung dịch saponin tam thất chuẩn với các nồng độ dung dịch đo quang trong khoảng 3,00-7,00 μg/ml. Kết quả được thể hiện trong hình 2 - PL1.
Nhận xét: Giá trị R2 = 0,9967 > 0,995 cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát 3,00 – 7,00 μg/ml có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ saponin và độ hấp thụ quang. Do vậy, phương pháp đo quang có thể sử dụng để định lượng saponin tam thất trong các mẫu nghiên cứu.
Kết luận: Định lượng saponin toàn phần bằng phương pháp đo quang phổ UV –
VIS tại bước sóng 550 nm trong khoảng nồng độ 3,00 – 7,00 μg/ml.
3.1.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của tá dược tới độ hấp thụ quang của pellet saponin tam thất
Tiến hành làm phản ứng màu với các tá dược dự kiến trong thành phần pellet (cách tiến hành tương tự mục 2.3.1) và đo quang tại bước sóng 550nm. Kết quả thể hiện trong bảng 3 – PL1.
Nhận xét: Tại bước sóng 550nm, độ hấp thụ quang của các tá dược hầu hết đều <
2% so với độ hấp thụ quang của saponin tam thất. Lactose có độ hấp thụ quang tại bước sóng 550nm ở nồng độ 10μg/ml là khá cao (0,243).
Độ hấp thụ quang của thành phần tá dược (trừ lactose) hầu như không ảnh hưởng đến kết quả độ hấp thụ quang của các saponin tam thất. Các mẫu pellet chứa lactose sẽ được làm mẫu placebo để trừ nền.
Kết luận: Có thể dùng phương pháp định lượng saponin tam thất bằng phương pháp
đo quang phổ UV-VIS để định lượng saponin tam thất trong các mẫu pellet bào chế.
31
3.1.3.1. Định lượng 5 saponin notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1 và ginsenosid Rd trong cao khô saponin tam thất nguyên liệu
Tiến hành định lượng hàm lượng của 5 saponin trong cao khô saponin tam thất nguyên liệu theo phương pháp HPLC như đã mô tả trong mục 2.4.1.
Kết quả hàm lượng notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1, ginsenosid Rd trong cao khô saponin tam thất nguyên liệu bảng 4 - PL1.
Nhận xét: Theo Dược điển Trung Quốc 2015, tổng hàm lượng 5 saponin
notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1 và ginsenosid Rd khơng được ít hơn 75% khi dùng đường uống. Đối chiếu với kết quả về tổng hàm lượng 5 saponin này trong cao khơ saponin tồn phần thu được (80,39 %) cho thấy sơ bộ cao khô tam thất tinh chế đạt tiêu chuẩn về hàm lượng các saponin chính khi dùng đường uống.
3.1.3.2. Đặc tính vật lí
a. Một số đặc tính vật lí của cao khơ tam thất nguyên liệu
Kết quả đánh giá đặc tính của cao khô tam thất được thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Một số đặc tính vật lí của cao khô saponin tam thất nguyên liệu
STT Chỉ tiêu Kết quả
1 Cảm quan Dạng bột mịn màu trắng, hơi vàng nhạt
2 Phân bố kích thước Cao khơ saponin tam thất qua hết cỡ rây 0,125 mm
3 Hình ảnh SEM Hình 3 - PL1
4 Mất khối lượng do làm khô 4,59 ± 0,20%
5 Độ trơn chảy Chỉ số nén CI = 34,91 ± 0,91 6 Điểm nóng chảy 196,67 ± 2,03oC
Nhận xét:
- Cao khô saponin tam thất ở dạng bột rất mịn theo DĐVN V.
- Hình ảnh SEM cho thấy cao khơ saponin tam thất có hình dạng góc cạnh, bề mặt nhẵn. - Cao khơ saponin có kết quả mất khối lượng do làm khô thấp dưới 5%, đạt tiêu chuẩn
về mất khối lượng do làm khô cho cao khô theo DĐVN V
- Cao khơ saponin tam thất có giá trị CI cao (34,91), do vậy bột trơn chảy rất kém. Do vậy, để phân liều đồng đều, cần có các biện pháp cải thiện độ trơn chảy như tạo lớp phủ khô bằng các hạt nano silica 1% [85], tạo hạt, tạo pellet,…
- Điểm nóng chảy của saponin tam thất là 196,67o
C, nhiệt độ này cũng gần với pic điểm thu nhiệt ở giản đồ DSC. Nhiệt độ nóng chảy của cao khơ saponin tam thất ngun liệu gần với kết quả nhiệt độ nóng chảy của ginsenosid Rb1 (197oC) và của ginsenosid Rg1
32
(194oC) trong nghiên cứu của Kim và cộng sự [32], điều này có thể do ginsenosid Rb1 và Rg1 chiếm tỉ lệ cao nhất (trên 60%) trong cao khô saponin tam thất.
b. Dạng thù hình ở trạng thái rắn
Phổ FTIR, giản đồ nhiệt DSC và phổ nhiễu xạ tia X
Kết quả phổ FTIR và giản đồ nhiệt DSC và phổ nhiễu xạ tia X của cao khô saponin tam thất được thể hiện trong hình 4, hình 5 và hình 6 - PL1.
Nhận xét: Cao khô saponin tam thất được đặc trưng bởi các dải sóng: 3228 cm-1
(các liên kết O-H), 2929 cm-1 (các liên kết C-H), 1252 cm-1, 1088 cm-1 và 1047 cm-1 (các liên kết C-O). Giản đồ nhiệt DSC của cao khơ saponin tam thất có 01 điểm thu nhiệt ở 210,07oC, đây có thể là nhiệt độ nóng chảy của cao khơ saponin tam thất [35], [65], trong khi đó phổ nhiễu xạ tia X cũng khơng có các đỉnh nhiễu xạ đặc trưng. Từ những kết quả này cho thấy cao khô saponin tam thất tồn tại ở trạng thái vơ định hình.
c. Độ tan trong nước ở các pH khác nhau
Độ tan (S) của các saponin được thể hiện như trong bảng 5 - PL1.
Nhận xét: Liều dùng cao nhất (D) của notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1,
ginsenosid Re, ginsenosid Rb1 và ginsenosid Rd theo nghiên cứu trước đều là 8,9 mg [48]. Do đó, giá trị D/S của cao khô saponin tam thất và các saponin notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1 và ginsenosid Rd trong các môi trường pH khác nhau đều nhỏ hơn 250 ml, thuộc nhóm tan tốt [68].
Kết luận: Cao khơ saponin tam thất và các saponin notoginsenosid R1, ginsenosid
Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1 và ginsenosid Rd tan tốt trong các môi trường pH 1,2; 4,5; 6,8 và 7,5.
d. Tính hút ẩm
Tiến hành đánh giá tính hút ẩm của cao khô saponin tam thất nguyên liệu theo phương pháp đã nêu trong mục 2.4.3.
Kết quả độ hút ẩm của cao khô saponin tam thất thể hiện trong bảng 6 – PL1.
Nhận xét: Cao khơ saponin tam thất có bản chất là cao dược liệu nên khá hút ẩm,
chỉ sau khoảng 4 giờ thì hàm ẩm trong cao đã tăng lên hơn 10,14%. Tính hút ẩm đóng một vai trị quan trọng trong tương tác giữa các tiểu phân trong cao khơ dược liệu và có thể góp phần làm cho bột kém chảy cũng như ảnh hưởng tiêu cực đến độ ổn định vật lý và hóa học của cao dược liệu như tốc độ hịa tan, phân hủy hóa học và khả năng nén [21], [16]. Do vậy trong q trình bào chế cần lưu ý kiểm sốt độ ẩm môi trường.
3.1.3.3. Độ ổn định của saponin tam thất
33
Đồ thị biểu diễn độ ổn định của các saponin trong các môi trường khác nhau được thể hiện trong hình 7 - PL1.
Nhận xét:
Các saponin notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1 và ginsenosid Rd trong tam thất bền trong môi trường dung dịch NaOH 1N, đệm phosphat pH 4,5; đệm phosphat pH 6,8; peroxid 3% trong 24 giờ. Tuy nhiên sau sau 7 và 14 ngày thì các saponin vẫn cịn bền trong mơi trường nước và đệm phosphat pH 4,5, còn trong các môi trường dung dịch NaOH 1N, đệm phosphat pH 6,8 và peroxid 3% thì hầu hết các saponin đều bị phân hủy gần như hồn tồn, riêng chỉ có ginsenosid Rd là bền vững hơn so với các saponin khác. Trong khi đó có thể dễ dàng nhận thấy các saponin rất kém bền trong môi trường pH 1,2; chỉ sau khoảng 4 giờ phần trăm các saponin còn lại đều dưới 50% và gần như bị thủy phân hết sau 24 giờ. Trên sắc kí đồ của dung dịch saponin trong mơi trường acid sau 4 giờ (hình 8 - PL1) có xuất hiện nhiều pic lạ, chứng tỏ saponin đã bị thủy phân thành các chất khác.
Do vậy cần tránh phối hợp saponin với các tá dược có tính acid và tính oxy hóa mạnh. Khi ứng dụng vào các dạng bào chế để uống, việc bao màng tan trong ruột có thể là biện pháp hữu ích để bảo vệ dược chất tránh tác động của acid dịch vị.
b. Độ ổn định hóa học ở trạng thái rắn
Tiến hành đánh giá độ ổn định hóa học của cao khơ saponin tam thất theo phương pháp đã nêu trong mục 2.4.3.
Kết quả hàm lượng của saponin tam thất so với ban đầu trong các điều kiện khác nhau được thể hiện ở bảng 7 - PL1 và phổ nhiễu xạ tia X và giản đồ nhiệt DSC của mẫu cao khô saponin tam thất được thể hiện ở hình 9, hình 10 – PL1.
Nhận xét: Trong các điều kiện bị tác động nhiệt độ cao, hàm ẩm cao và ánh sáng
UV thì ngun liệu saponin vẫn giữ được trạng thái vơ định hình thể hiện qua hình ảnh phổ nhiễu xạ tia X. Kết quả định lượng cho thấy nguyên liệu cao khô saponin tam thất hàm lượng vẫn cao thay đổi không nhiều (trên 94%), chỉ riêng có mẫu ở nhiệt độ 105 o
C thì hàm lượng các saponin giảm còn xuống khoảng 90%. Ngoài ra giản đồ nhiệt DSC khơng xuất hiện pic lạ, các mẫu đều có điểm chảy giống với mẫu nguyên liệu ban đầu ở 210 oC. Với kết quả nghiên cứu thu được, trong quá trình nghiên cứu bào chế cần chú ý kiểm sốt điều kiện nhiệt độ khơng q 80 oC.
3.1.3.4. Hệ số phân bố dầu nước
34
Kết quả hệ số phân bố dầu nước của saponin trong cao khô tam thất được thể hiện trong bảng 8 - PL1.
Nhận xét: Các saponin tam thất notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re,
ginsenosid Rb1 và ginsenosid Rd có Log P khoảng từ -0,82 tới 0,52. Dược chất với giá trị log P < 1,72 được phân loại thuộc nhóm thấm kém [28], [45], như vậy các saponin notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re, ginsenosid Rb1 và ginsenosid Rd được phân loại vào nhóm thấm kém.
Kết luận: Các saponin notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Re,
ginsenosid Rb1 và ginsenosid Rd có độ tan tốt nhưng thấm kém do vậy các saponin này được phân loại vào nhóm III trong bảng phân loại sinh dược học BCS, kết quả này cũng tương tự so với kết quả của các nghiên cứu trước đó [48], [34].
3.1.4. Đánh giá tƣơng tác giữa dƣợc chất và tá dƣợc
Tiến hành đánh giá tương tác giữa dược chất và tá dược theo phương pháp đã nêu trong mục 2.4.4.
Kết quả hàm lượng các saponin chính trong tam thất so với ban đầu sau khi tương tác với tá dược được thể hiện ở bảng 9 - PL1.
Nhận xét:
Kết quả đánh giá tương thích giữa các saponin trong cao khô tam thất và các tá dược cho thấy màu sắc của saponin không thay đổi tuy nhiên hàm lượng của các saponin trong một số hỗn hợp với tá dược có xu hướng giảm. Các mẫu có PVP K30, carbopol 934, natri crosscarmelose, natri starch glycolat, natri lauryl sulfat có sự giảm rõ rệt về tỷ lệ các saponin sau 4 tuần lão hóa cấp tốc. Trong khi đó, với các tá dược cịn lại thì sau 4 tuần tỷ lệ hàm lượng các saponin đều cao (> 90%). Do vậy có thể chọn các tá dược này để bào chế pellet.
Kết luận chung:
Sơ bộ đã đánh giá được hầu hết các đặc tính cơ bản của cao khơ saponin tam thất nguyên liệu. Kết quả cho thấy cao khơ tam thất có một số nhược điểm như hút ẩm mạnh, trơn chảy kém, không bền trong mơi trường acid dịch vị dạ dày, có khả năng bị oxy hố nếu tiếp xúc với tác nhân oxy hoá trong thời gian dài, không bền ở nhiệt độ lớn hơn 105oC, tính thấm kém và tương tác với một số tá dược. Vì vậy, để đảm bảo độ ổn định của hoạt chất và cải thiện sinh khả dụng đường uổng, trong nghiên cứu này, saponin tam thất đã được bào chế dưới dạng pellet để cải thiện dộ trơn chảy, chịu nén, quá trình bào chế pellet cần bao tan trong ruột, tránh tác nhân có tính oxy hóa mạnh trong thời gian dài, không nên sấy ở nhiệt độ quá cao ở 105oC, cần thêm tá dược tăng thấm.
35
3.1.5. Khảo sát loại và tỉ lệ chất hóa dẻo/polyme
Tiến hành khảo sát loại và tỉ lệ chất hóa dẻo/polyme như phương pháp đã mô tả trong mục 2.4.5.
Kết quả:
Cảm quan
Kết quả khảo sát sơ bộ loại và tỷ lệ chất hóa dẻo/polyme được thể hiện trong bảng 3.2 và hình 11 - PL1.
Bảng 3.2. Kết quả cảm quan khảo sát sơ bộ loại và tỷ lệ chất hóa dẻo/polyme
Tỷ lệ CHD TEC PEG 400 DBP
10% Màng film trong suốt, giòn, nứt vỡ
Màng film trong suốt, bề mặt màng phim khơng nhẵn, có vân
Màng trong suốt, giòn, nứt vỡ 25% Màng film trong
suốt giịn, nứt vỡ ít hơn
Màng film trong suốt, bề mặt màng khơng nhẵn, có vân
Màng hơi đục, giòn, nứt vỡ 50% Màng trong suốt,
đẹp, không bị nứt vỡ
Màng film trong suốt, đẹp, nhẵn
Màng đục, giòn, nứt vỡ
100% Màng hơi đục, không bị nứt vỡ
Màng hơi đục, dẻo, sờ dính tay Màng đục, có vân trên bề mặt
Giản đồ nhiệt DSC
Giản đồ nhiệt DSC của các hỗn hợp polyme : chất hóa dẻo được thể hiện ở hình 12 - PL1.
Nhận xét:
Từ giản đồ nhiệt DSC đã đo, nhận thấy nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh Tg của