Hình 3 .1 Kết quả định tính các nhóm chất trong Ngũ vị tử Ngọc Linh
Hình 3.3 Đường chuẩn flavonoid
Phương trình đường chuẩn flavonoid: y = 3.0762 – 0.0348, trong đó x là nồng độ chất chuẩn (mg/ml); y là mật độ quang.
Độ tuyến tính của đường chuẩn được đánh giá thơng qua hệ số tương quan R2. Kết quả đánh giá đường chuẩn acid gallic cho thấy R2 lớn hơn 0,99, chứng tỏ đường chuẩn được xây dựng có độ tuyến tính cao đảm bảo để thực hiện phép phân tích định lượng flavonoid tính theo catechin.
3.2.3.2. Kết quả định lượng
Kết quả định lượng flavonoid được thể hiện ở Bảng 3.6
0,332 0,629 1,275 2,528 3,368 y = 3,0762x - 0,0348 R² = 0,9974 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
28
Bảng 3.6. Kết quả định lượng flavonoid.
Mẫu Khối lượng cân (mg) Thể tích pha lỗng (ml) Nồng độ C (mg/ml) Mật độ quang Abs Hàm lượng (%) 1 196,9 50 0,23594 0,691 6,61 2 213,5 50 0,264222 0,778 6,83 3 217,8 50 0,263247 0,775 6,67 Trung bình 6,70
Từ kết quả thu được cho thấy cao chiết Ngũ vị tử Ngọc Linh có hàm lượng flavonoid là 6,70%.
3.3. Kết quả đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên mơ hình gây viêm gan cấp bằng paracetamol
3.3.1. Kết quả hình ảnh gan đại thể
Lô 1: Sinh lý Lô 2: Bệnh lý
29
Lơ 5: CNVT 1000
Hình 3.4. Hình ảnh gan đại thể của các lô chuột.
Nhận xét: Từ Hình 3.4 ta thấy:
+ Lơ 1 (sinh lý): Gan màu sẫm, mặt nhẵn, mềm, không phù nề, không sung huyết.
+ Lô 2 (bệnh lý): Gan bạc màu, bề mặt sần, gan xốp, nhẹ, khối gan to. + Lơ 3 (chứng dương): Nhiều gan sẫm màu, có một số ít bạc màu, mặt khá nhẵn, ít xốp.
+ Lơ 4 (CNVT 500): Gan bạc màu, một số ít sẫm màu, bề mặt khá sần, gan xốp.
+ Lô 5 (CNVT 1000): Gan sẫm màu, ít bạc màu, bề mặt khá nhẵn, ít phù nề, ít sung huyết.
3.3.2. Kết quả đo hoạt độ AST
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của CNVT lên hoạt độ AST trong huyết thanh chuột
Lô Tên lô n AST (U/l) p
1 Sinh lý 7 193,3±9,4 p1-2 = 0,000 2 Bệnh lý 11 2292,3±369.5
3 Chứng dương 11 1211,8±102,0 p2-3 = 0,042 4 CNVT 500 9 1981,6±267,6 p2-4 = 0,950 5 CNVT 1000 10 1087,7±146,3 p2-5 = 0,010
30
Hình 3.5. Kết quả phân tích hoạt độ AST
* p<0,05; *** p<0,001 so sánh với lô bệnh lý
Nhận xét: Kết quả ở Bảng 3.7 và Hình 3.5 cho thấy
- Hoạt độ AST ở lô bệnh lý (gây độc bằng paracetamol) tăng cao rõ rệt so với lô chứng sinh lý (tăng xấp xỉ 12 lần) (p< 0,001).
- Uống CNVT 500 mg/kg làm giảm hoạt độ AST (giảm 13,5%) so với lô bệnh lý nhưng sự khác biệt này là khơng có ý nghĩa (p>0,05).
- Uống CNVT 1000 mg/kg làm giảm rõ rệt hoạt độ AST (giảm 52,6%) so với lô bệnh lý (p<0,05).
- Uống silymarin 200 mg/kg làm giảm rõ rệt hoạt độ AST (giảm 47,1%) so với lô bệnh lý (p<0,05).
3.3.3. Kết quả đo hoạt độ ALT
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của CNVT lên hoạt độ ALT trong huyết thanh chuột
Lô Tên lô n ALT (U/l) p
1 Sinh lý 7 86,4±4,4 p1-2 = 0,000 2 Bệnh lý 11 2090,4±367,9 3 Chứng dương 11 893,4±199,9 p2-3 = 0,001 4 CNVT 500 9 1817,6±188,8 p2-4 = 0,992 5 CNVT 1000 10 1041,8±143,8 p2-5 = 0,020 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Sinh lý Bệnh lý CNVT500 CNVT1000 Silymarin Ho ạt độ A ST ( U/l) Hoạt độ AST * * ***
31
Hình 3.6. Kết quả phân tích hoạt độ ALT
* p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 so sánh với lô bệnh lý
Nhận xét: Kết quả ở Bảng 3.8 và Hình 3.6 cho thấy
- Hoạt độ ALT ở lô bệnh lý (gây độc bằng paracetamol) tăng cao rõ rệt (tăng xấp xỉ 24 lần) so với lô chứng sinh lý (p< 0,001).
- Uống CNVT 500 mg/kg làm giảm hoạt độ ALT (giảm 13,0%) so với lô bệnh lý nhưng sự khác biệt này là khơng có ý nghĩa (p>0,05).
- Uống CNVT 1000 mg/kg làm giảm rõ rệt hoạt độ ALT (giảm 50,2%) so với lô bệnh lý (p<0,05).
- Uống silymarin 200 mg/kg làm giảm rõ rệt hoạt độ ALT (giảm 57,3%) so với lô bệnh lý (p<0,01).
3.3.4. Kết quả định lượng TBARs
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của CNVT lên giá trị TBARs trong gan chuột.
Lô Tên lô n TBARs
(nmol/g protein) p 1 Sinh lý 7 6,06±0,36 p1-2 = 0,000 2 Bệnh lý 9 8,52±0,21 3 Chứng dương 9 7,30±0,29 p2-3 = 0,007 4 CNVT 500 9 7,71±0,36 p2-4 = 0,132 5 CNVT 1000 9 7,26±0,15 p2-5 = 0,008 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Sinh lý Bệnh lý CNVT500 CNVT1000 Silymarin Ho ạt độ A L T ( U/l) Hoạt độ ALT * ** ***
32
Hình 3.7. Kết quả phân tích hàm lượng TBARs
** p<0,01; *** p<0,001 so sánh với lô bệnh lý
Nhận xét: kết quả ở Bảng 3.9 và Hình 3.7 cho thấy
- Giá trị TBARs ở lô bệnh lý tăng cao rõ rệt so với lô chứng sinh lý (p<0,001) - Uống CNVT 500 mg/kg làm hàm lượng TBARs giảm so với lô bệnh lý nhưng sự khác biệt này là khơng có ý nghĩa (p>0,05).
- Uống CNVT 1000 mg/kg làm giảm rõ rệt giá trị TBARs so với lô bệnh lý (p<0,01).
- Uống silymarin 200 mg/kg làm giảm rõ rệt giá trị TBARs so với lô bệnh lý (p<0,01).
3.3.5. Kết quả định lượng GSH
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của CNVT lên giá trị GSH trong gan chuột.
Lô Tên lô n GSH
(μM/g protein) p 1 Sinh lý 7 8,63±0,40 p1-2 = 0,000 2 Bệnh lý 9 4,89±0,38 3 Chứng dương 9 8,00±0,36 p2-3 = 0,000 4 CNVT 500 9 5,46±0,38 p2-4 = 0,814 5 CNVT 1000 9 6,62±0,50 p2-5 = 0,022 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 Sinh lý Bệnh lý CNVT500 CNVT1000 Silymarin Hàm lượn g T B A R s (n m o l/g p ro tein ) Hàm lượng TBARS ** ** ***
33
Hình 3.8. Kết quả phân tích hàm lượng GSH
* p<0,05; *** p<0,001 so sánh với lô bệnh lý
Nhận xét: kết quả ở Bảng 3.10 và Hình 3.8 cho thấy
- Giá trị GSH ở lô bệnh lý giảm rõ rệt so với lô chứng sinh lý (p<0,05)
- Uống CNVT 500 mg/kg làm tăng giá trị GSH so với lô bệnh lý nhưng sự khác biệt này là khơng có ý nghĩa (p>0,05).
- Uống CNVT 1000 mg/kg làm tăng rõ rệt giá trị GSH so với lô bệnh lý (p<0,05).
- Uống silymarin 200 mg/kg làm tăng rõ rệt giá trị GSH so với lô bệnh lý (p<0,05). 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 Sinh lý Bệnh lý CNVT500 CNVT1000 Silymarin Hàm lượn g GSH (μ M/g p ro tein ) Hàm lượng GSH * *** ***
34
CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN
4.1. Về kết quả định tính các nhóm chất trong dược liệu Ngũ vị tử Ngọc Linh
Kết quả định tính các nhóm chất bằng phương pháp hóa học cho thấy trong Ngũ vị tử Ngọc Linh chứa các thành phần: flavonoid, courmarin, polysaccharid, acid hữu cơ, chất béo. Kết quả này phù hợp với các kết quả nghiên cứu đã được công bố trong tài liệu [1], [8].
Kết quả định tính giúp phân tích sơ bộ thành phần hóa học và là bước cơ sở cho việc định hướng chiết xuất và phân lập các hợp chất có trong dược liệu Ngũ vị tử.
4.2. Về kết quả định lượng polyphenol, flavonoid.
Hàm lượng polyphenol toàn phần và flavonoid trong cao chiết được xác định lần lượt là 8,72% và 6,70%. Như vậy hàm lượng của 2 nhóm chất này trong cao chiết Ngũ vị tử là khá cao. Các hợp chất polyphenol và flavonoid đã được chứng minh là có liên quan đến hoạt động chống oxy hóa trong hệ thống sinh học [17]. Như vậy cao chiết Ngũ vị tử Ngọc Linh có chứa các hoạt chất nhiều tiềm năng ứng dụng và là cơ sở cho việc nghiên cứu các hoạt động bảo vệ cơ thể chống lại sự oxy hóa.
4.3. Về tác dụng bảo vệ gan của cao chiết Ngũ vị tử Ngọc Linh
* Hình ảnh gan đại thể
Ở lơ chuột bệnh lý qua sát thấy hình ảnh gan bạc màu, xốp, bè gan to, bề mặn khơng nhẵn, có các nốt sần. Điều này chứng tỏ paracetamol đã gây tổn thương các mô gan. Ở lô chuột được uống CNVT với mức liều 500 mg/kg kết quả hình ảnh cho thấy có nhưng cải thiện tuy nhiên chưa chưa rõ rệt so với lô chuột bệnh lý. Sự khác biệt chỉ được thấy rõ trên hình ảnh gan đại thể của lơ chuột khi uống CNVT ở mức liều 1000 mg/kg và lô chuột chứng dương khi uống silymarin. Ở hai lơ này hình ảnh gan sẫm màu nhiều, ít bạc màu, bề mặt khá nhẵn. Ở lơ uống CNVT 1000 mg/kg ít phù nề, ít sung huyết.
* Hoạt độ AST, ALT
AST và ALT là hai loại enzym được tìm thấy chủ yếu ở các tế bào gan. Khi tế bào gan bị phá hủy AST và ALT sẽ được giải phóng và đi vào máu. Đặc biệt trong trường hợp viêm gan cấp tính nồng độ AST và ALT trong máu sẽ tăng lên một cách đột ngột. Do đó việc xác định hoạt độ AST và ALT là một xét nghiệm hữu ích để phát hiện tổn thương gan và mức độ tổn thương gan.
35
Kết quả thực nghiệm cho thấy hoạt độ AST và ALT ở lô bệnh lý tăng cao (lần lượt là 12 và 24 lần) so với lô sinh lý. Điều này chứng tỏ paracetamol đã gây tổn thương tế bào gan cấp và làm giải phóng các enzym này vào máu. Việc sử dụng CNVT liều 500 mg/kg có làm giảm hoạt độ AST (13,5) và ALT (50,2%) so với lô bênh lý nhưng sự khác biệt này là khơng có ý nghĩa với p>0,05. Sự khác biệt thấy rõ và có ý nghĩa ở lơ chuột uống CNVT liều 1000 mg/kg khi làm giảm hoạt độ AST (52,6%) và ALT (50,2%) so với lơ bệnh lý với p<0,05. Do đó khi sử dụng mức liều cao 1000 mg/kg CNVT đã cho thấy khả năng ức chế tăng hoạt độ enzym AST và ALT phù hợp với những nghiên cứu đã được công bố. Lô chứng silymarin (silymarin là một hoạt chất được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị các bệnh về gan) đã chứng minh được tác dụng thông qua việc làm giảm hoạt độ AST (47,1%) và ALT (57,3%) so với lô bệnh lý với p<0,05.
Kết quả đo hoạt độ AST và ALT hoàn tồn tương ứng với sự biến đổi hình ảnh gan đại thể ở các lô chuột.
* GSH, TBARs
GSH là một chất chống oxy hố đóng vai trị quan trọng trong bảo vệ tế bào khỏi tác hại của gốc tự do, làm giảm chất oxy hóa nội sinh và chống stress oxy hoá ngoại sinh [18], [44]. Gây tổn thương gan bằng paracetamol làm giảm GSH trong gan. Các chất bảo vệ gan hiệu quả sẽ làm phục hồi hàm lượng GSH trong mô gan. TBARs (các cơ chất phản ứng với TBA) là sản phẩm peroxide hóa lipid, được hình thành bởi các gốc tự do tấn công màng tế bào và được sử dụng rộng rãi như là một dấu ấn sinh học về sự tổn thương peroxide hóa lipid [41]. TBARs tăng cao khi gan bị nhiễm độc bởi paracetamol. Các chất bảo vệ gan hiệu quả sẽ làm giảm được hàm lượng TBARs có trong mơ gan.
Kết quả ở Bảng 3.9 và Bảng 3.10 cho thấy lơ chuột bệnh lý có hàm lượng
GSH giảm có ý nghĩa thống kê và TBARs tăng có ý nghĩa thống kê so với lơ sinh lý. Sự thay đổi hàm lượng GSH và TBARs do sự stress oxy hóa và peroxide hóa lipid xảy ra mạnh mẽ ở gan. Ở lô chuột được uống CNVT với liều 500 mg/kg không cho thấy sự khác biệt đáng kể về hàm lượng GSH và TBARs so với lô chuột bệnh lý. Ở lô chuột uống CNVT liều 1000 mg/kg và lô chuột uống silymarin đã cải thiện trạng thái stress oxy hóa và peroxide hóa lipid ở gan theo xu hướng làm giảm TBARs và làm tăng GSH. Như vậy việc uống CVNT và silymarin đã làm hạn chế tình trạng stress oxy hóa gan do paracetmol gây ra. Kết quả này đã chứng minh hoạt động chống oxy hóa của cao chiết Ngũ vị tử Ngọc Linh và hoàn toàn phù hợp với những tài liệu nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa đã được cơng bố [11], [15], [45].
36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 1. Kết luận
Từ các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ gan của cao chiết Ngũ vị tử Ngọc Linh, khóa luận đã thu được những kết quả sau:
- Bằng phương pháp định tính hóa học các nhóm chất đã xác định được trong dược liệu Ngũ vị tử Ngọc Linh có chứa các nhóm hợp chất: flavonid, courmarin, acid hữu cơ và chất béo.
- Kết quả định lượng polyphenol và flavonoid có trong cao chiết Ngũ vị tử Ngọc Linh khá cao lần lượt là 8,72% và 6,70%.
- Cao chiết Ngũ vị tử Ngọc Linh có khả năng bảo vệ gan trên mơ hình gây viêm gan cấp bằng paracetamol. Với liều cao 1000 mg/kg cao chiết Ngũ vị tử Ngọc Linh cho thấy khả năng làm giảm hoạt độ AST và ALT trong huyết thanh rất hiệu quả. Bên cạnh đó cao chiết Ngũ vị tử Ngọc Linh liều cao 1000 mg/kg còn cải thiện được trạng thái stress oxy hóa trong gan qua hiệu quả làm giảm lượng TBARs và làm tăng lượng GSH trong mô gan.
2. Đề xuất
Từ những kết quả của khóa luận, cần tiếp tục các nghiên cứu thêm qua các hướng sau:
- Tiếp tục sàng lọc và định lượng các hợp chất lignan từ dược liệu Ngũ vị tử Ngọc Linh.
- Nghiên cứu các thành phần chính có tác dụng bảo vệ gan từ Ngũ vị tử Ngọc Linh và tiến hành chiết phân đoạn nhằm nâng cao hiệu quả tác dụng bảo vệ gan.
TÀI LIỆU THAM KHẢO: Tài liệu tham khảo Tiếng Việt:
1. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, tr. 872-875.
2. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung và cộng sự (2006), Cây thuốc và động vật
làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr. 416-423.
3. Bộ môn Dược liệu (2012), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Trường Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh.
4. Bộ môn Dược liệu (2010), Thực tập Dược liệu, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 5. Bộ Y tế (2015), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học, tr. 1273-1274. 6. Bộ Y tế (2015), "Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị ngộ độc", tr. 30-31.
7. Nguyễn Mạnh Cường, Trần Thu Hường và cộng sự (2016), "Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của rễ cây Xáo tam phân (Paramingya trimera) trên chuột gây tổn thương gan bằng paracetamol", Tạp chí Khoa học và Cơng nghệ, 54(1), tr. 37- 45.
8. Nguyễn Thượng Dong (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của
thuốc từ dược thảo, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 309-311.
9. Đỗ Thị Oanh, Phạm Thanh Kỳ và cộng sự (2010), "Nghiên cứu tác dụng chống viêm và bảo vệ gan của cao sói rừng trên thực nghiệm", Tạp chí Dược học
411(50), tr. 36-39.
10. Nguyễn Trọng Tường, Huỳnh Duy Khang và cộng sự (2020), "Xác định hàm lượng polyphenol, flavonoid và hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết từ Vạn thọ (Tagetes erecta L.) hoa vàng và hoa cam", Tạp chí Nghiên cứu khoa học
và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô, 2020(08), tr. 188-198.
Tài liệu tham khảo Tiếng Anh:
11. Chen X., Tang R., et al. (2019), "Physicochemical properties, antioxidant activity and immunological effects in vitro of polysaccharides from
Schisandra sphenanthera and Schisandra chinensis", Int J Biol Macromol,
131, pp. 744-751.
12. Li Z., He X., et al. (2018), "A review of polysaccharides from Schisandra
chinensis and Schisandra sphenanthera: Properties, functions and
applications", Carbohydr Polym, 184, pp. 178-190.
13. Lu Y., Chen D. F. (2009), "Analysis of Schisandra chinensis and Schisandra
14. Mai N. T., Doan V. V., et al. (2021), "Chemical constituents from Schisandra
sphenanthera and their cytotoxic activity", Nat Prod Res, 35(20), pp. 3360-
3369.
15. Wang X., Yu J., et al. (2018), "Characteristics and Antioxidant Activity of Lignans in Schisandra chinensis and Schisandra sphenanthera from Different Locations", Chem Biodivers, 15(6), pp. e1800030.
16. Flora of China, 7, pp. 39-43.
17. Chang Hung-Chi, Guan-Jhong Huang, et al. (2007), "Antioxidant activities and polyphenol contents of six folk medicinal ferns used as “Gusuibu”",
Botanical Studies, 48(4), pp. 397.
18. Enns G. M., Cowan T. M. (2017), "Glutathione as a Redox Biomarker in Mitochondrial Disease-Implications for Therapy", J Clin Med, 6(5), pp.