Thành phần Retinyl palmitat Tween 20 Nước tinh khiết
Khối lượng (g) 0,2 0,2 9,6
a. Đánh giá khả năng thấm
Lấy 1ml dịch trong ngăn nhận, đem pha loãng đến nồng độ thích hợp bằng ethanol 96% và định lượng bằng quang phổ UV-VIS. Mẫu trắng là mẫu được xử lí tương tự với da lợn trong điều kiện thử nghiệm.
b. Đánh giá khả năng lưu trữ
Phần da lợn đóng vai trị màng khuếch tán giữa ngăn cho và ngăn nhận của hệ thống thử giải phóng qua màng Hanson Research được lấy ra sau 24 giờ và rửa sạch bằng dung dịch saline đệm phosphate pH 7,4 rồi thấm khô. Dùng kéo cắt nhỏ miếng da, cho vào ống ly tâm, thêm chính xác 3 ml ethanol 96%, đậy nắp kín, siêu âm 30 phút. Sau đó, đem li tâm trong máy siêu li tâm với tốc độ 15000 rpm trong 15 phút ở 20oC. Phần dịch thu được đem pha loãng đến nồng độ thích hợp, lọc qua màng lọc cellulose acetat 0,45 μm để loại bỏ tạp chất. Định lượng bằng phương pháp đo quang, sử dụng mẫu trắng là mẫu được xử lí tương tự với da lợn.
Cơng thức tính lượng dược chất lưu trữ trên da: m = mRP
1,767
Trong đó: m là lượng dược chất lưu trữ trên da (μg/cm2) 1,767 là diện tích da lưu trữ dược chất (cm2)
2.4.3.8. Phương pháp đánh giá đặc tính bít giữ của gel chứa NLC-RP 1%
Đánh giá đặc tính bít giữ của gel chứa NLC-RP 1% thông qua chỉ số mất nước qua biểu bì TEWL. TEWL là chỉ số xác định lượng nước khuếch tán qua lớp sừng lên bề mặt da trong một đơn vị thời gian. Nước bốc hơi từ da được đo bằng cách sử dụng
24
một đầu dò được đặt tiếp xúc với bề mặt da và chứa các cảm biến phát hiện sự thay đổi mật độ hơi nước [2].
Tham khảo tài liệu [28], thiết kế thử nghiệm ex vivo đánh giá đặc tính sinh lí
của gel chứa NLC-RP 1%:
Tai lợn được rửa bằng nước muối sinh lí, lau khơ bằng khăn mềm. Các vùng da cịn ngun vẹn, khơng có vết thương hoặc vết xước có thể nhìn thấy được chọn và đánh dấu (1,5×1,5cm) và tính tồn vẹn của da được kiểm soát bằng cách đánh giá sự mất nước qua biểu bì. Chỉ những vùng da có giá trị TEWL<13 g/m2/h mới được đưa vào thử nghiệm. Các khu vực có giá trị TEWL>13 g/m2/h được coi là hàng rào bảo vệ da bị phá vỡ và do đó bị loại khỏi thử nghiệm. Sau đó, 0,2 g gel được bôi lên vùng da được chọn bằng găng tay và đánh giá sau 0, 3h, 7h bằng đầu TEWL của thiết bị nghiên cứu da DermaLab.
2.4.5. Phương pháp xử lí số liệu
Các kết quả thu được xử lý thống kê với sự hỗ trợ của phần mềm Microsoft Excel 2016 (n=3, TB±SD).
25
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Thẩm tra độ tuyến tính của phương pháp định lượng retinyl palmitat bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang UV-VIS phương pháp đo độ hấp thụ quang UV-VIS
3.1.1. Xác định điểm hấp thụ cực đại
Tiến hành pha dung dịch retinyl palmitat có nồng độ 5 μg/ml, đem quét độ hấp thụ quang ở bước sóng từ 200 nm đến 800 nm. Dựa vào quang phổ của retinyl palmitat, tìm ra bước sóng cực đại λmax = 325 nm được sử dụng để định lượng hoạt chất.
3.1.2. Xây dựng đường chuẩn
Tiến hành pha các mẫu thử có nồng độ retinyl palmitat lần lượt là 3, 4, 5, 7, 9, 10 μg/ml và đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 325 nm. Kết quả thể hiện trong bảng 3.1 và hình 3.1.
Bảng 3.1. Độ hấp thụ quang của retinyl palmitat theo nồng độ tại bước sóng 325 nm
Nồng độ (μg/ml) 3 4 5 7 9 10
Độ hấp thụ quang ABS 0,213 0,285 0,366 0,528 0,683 0,771
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn độ hấp thụ quang theo nồng độ
Kết quả R2 =0,9997 (>0,99) cho thấy sự tuyến tính giữa độ hấp thụ quang và nồng độ retinyl palmitat trong khoảng nồng độ 3 μg/ml đến 10 μg/ml.
Như vậy có thể sử dụng phương pháp đo quang để định lượng retinyl palmitat trong dung dịch ở bước sóng 325 nm.
3.2. Khảo sát thơng số kĩ thuật và công thức bào chế tiểu phân NLC-RP 3.2.1. Khảo sát tốc độ khuấy từ 3.2.1. Khảo sát tốc độ khuấy từ
Tiến hành bào chế NLC-RP theo mục 2.4.1.1 cho 3 mẫu M1, M2, M3 với tốc độ khuấy từ lần lượt là 400 rpm, 600 rpm và 800 rpm. Cơng thức mẫu được trình bày trong bảng 3.2.
26
Bảng 3.2. Thành phần công thức khảo sát tốc độ khuấy từ
Thành phần GMS CP MCT RP Tween 20 Nước tinh khiết
Khối lượng (g) 0,3 0,3 0,2 0,2 0,2 8,8
Về hình thức, các hỗn dịch tạo thành đều có màu trắng ngà đồng nhất và khơng
có các tiểu phân kích thước lớn quan sát được bằng mắt thường.
Hỗn dịch thu được đem xác định KTTP, PDI và thế zeta theo các bước ở mục 2.4.3.2. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.2.
Bảng 3.3. KTTP, PDI và thế zeta của M1, M2 và M3 (n=3, TB ± SD)
Công thức M1 M2 M3
KTTP (d.nm) 147,6 ± 2,31 135,3 ± 1,00 112,3 ± 2,76
PDI 0,079 ± 0,004 0,074 ± 0,004 0,135 ± 0,003
Thế zeta (mV) - 32,2 ± 0,265 - 37,7 ± 0,264 - 34,8 ± 0,153
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn KTTP, PDI và thế zeta của M1, M2 và M3 (n=3, TB ± SD)
Về KTTP: khi tăng tốc độ khuấy từ từ 400 rpm lên 800 rpm thì KTTP có xu
hướng giảm do khi tăng tốc độ khuấy từ làm tăng lực phân tán nhỏ các giọt dầu.
Về PDI: khi tăng tốc độ khuấy từ từ 400 rpm lên 600 rpm thì PDI giảm nhẹ
nhưng nếu tăng đến 800 rpm thì PDI tăng. Điều này cũng tương đồng với nghiên cứu của Rhythm cùng cộng sự về việc bào chế hệ SLN và NLC bằng phương pháp đồng nhất hóa tốc độ cao để ứng dụng trong điều trị bệnh vẩy nến. KTTP và PDI giảm mạnh khi tăng tốc độ đồng nhất hóa từ 5000 lên 15000 rpm với SLN và 20000 rpm với NLC, nếu tiếp tục tăng lên 24000 rpm thì PDI lại tăng nhẹ [7]. Nguyên nhân có thể do khi tốc độ khuấy từ q lớn sẽ phân cắt các tiểu phân có kích thước lớn trong hệ khi mới
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0 20 40 60 80 100 120 140 160 M1 M2 M3 PDI KT TP (d .n m ) Khảo sát tốc độ khuấy từ KTTP PDI -39 -38 -37 -36 -35 -34 -33 -32 -31 -30 -29 -28 M1 M2 M3 Th ế ze ta (m V) Khảo sát tốc độ khuấy từ
27
phối hợp pha dầu với pha nước thành các tiểu phân có kích thước rất nhỏ, tuy nhiên lại làm tăng động năng của hệ khiến một số tiểu phân nhỏ kết tụ lại với nhau, dẫn đến PDI tăng [47], [56].
Về thế zeta: thế zeta là thông số đặc trưng của sự ổn định vật lý của một công
thức [13]. Mẫu có độ ổn định rất tốt khi |thế zeta|>60mV và ổn định tốt khi |thế zeta|>30 mV [34]. Cả 3 mẫu đều có |thế zeta|>30mV chứng tỏ có độ ổn định vật lí tốt.
Như vậy, lựa chọn tốc độ khuấy từ là 600 rpm (tương ứng với công thức M2) để tiếp tục tiến hành khảo sát do M2 có KTTP nhỏ, PDI bé và giá trị tuyệt đối thế zeta cao.
3.2.2. Khảo sát tỉ lệ chất diện hoạt
Tiến hành bào chế NLC-RP theo mục 2.4.1.1 với tốc độ khuấy từ là 600 rpm cho 4 mẫu M4, M5, M2, M6 với nồng độ chất diện hoạt Tween 20 lần lượt là 1%, 1,5%, 2% và 3%. Công thức các mẫu được trình bày trong bảng 3.4.