CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.3. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của tiểu phân NLC-RP
2.4.3.1. Đánh giá hình thức hỗn dịch NLC-RP
Hỗn dịch tạo thành có màu trắng ngà, đồng nhất và khơng có các tiểu phân kích thước lớn quan sát được bằng mắt thường.
2.4.3.2. Đánh giá kích thước tiểu phân (KTTP), chỉ số đa phân tán (PDI), thế zeta và độ dẫn điện của môi trường
a. Đánh giá KTTP và PDI
Nguyên tắc:
- KTTP được xác định bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (dynamic light scattering). Khi chiếu chùm tia laser vào các hạt có kích thước khác nhau sẽ thu được mức độ tán xạ ánh sáng khác nhau. Bằng cách phân tích sự dao động của cường độ ánh sáng tán xạ có thể xác định được KTTP.
- Phân bố KTTP hay chỉ số đa phân tán (PDI) cho biết khoảng phân bố của KTTP trong hệ, giới hạn trong khoảng 0 đến 1. Thông thường, giá trị PDI nhỏ hơn 0,1 là tốt nhất, nhỏ hơn 0,3 là tối ưu và nhỏ hơn 0,5 là chấp nhận được [59].
21
Phân tán hỗn dịch thu được vào nước tinh khiết đã lọc qua màng cellulose acetat 0,2 µm sao cho số lượng photon được phát hiện mỗi giây (count rate) đạt giá trị 200–400 (Kcps). Tiến hành đo KTTP, chỉ số đa phân tán PDI của hỗn dịch bằng thiết bị Zetasizer Nano ZS90 và cuvet nhựa trong suốt.
b. Đánh giá thế zeta và độ dẫn điện của môi trường
Phân tán hỗn dịch thu được vào nước tinh khiết đã lọc qua màng cellulose acetat 0,2 µm đến độ pha lỗng thích hợp. Tiến hành đo thế zeta và dộ dẫn điện của môi trường bằng thiết bị Zetasizer Nano ZS90 và cuvet đo thế zeta.
2.4.3.3. Đánh giá độ ổn định vật lí của hỗn dịch NLC-RP
Mẫu được đựng trong lọ thủy tinh, bọc trong giấy nhôm và bảo quản trong điều kiện khơng có ánh sáng ở nhiệt độ phịng. Đánh giá KTTP, PDI, thế zeta và độ dẫn điện của môi trường của sau 3 ngày và 7 ngày.
2.4.3.4. Đánh giá hiệu suất nạp
a. Phương pháp định lượng hoạt chất nạp trong NLC
Để định lượng hoạt chất nạp trong NLC, tiến hành xử lí mẫu và định lượng phần hoạt chất tự do.
- Mẫu thử: cân chính xác khoảng 0,5 g hỗn dịch NLC vừa bào chế được vào bình định mức 10ml, định mức bằng nước tinh khiết. Đem hỗn dịch vừa pha loãng đi siêu li tâm ở tốc độ 20000 rpm trong 30 phút ở 20oC. Sau đó đem đi lọc thơ để loại các tiểu phân NLC chứa hoạt chất đã bị kết tụ. Pha loãng phần dịch lọc bằng ethanol 96% tới nồng độ thích hợp nằm trong khoảng 3-10 μg/ml.
- Mẫu trắng: ethanol 96%.
Tiến hành đo quang các dung dịch thử để tính tốn kết quả dựa vào đường chuẩn đã xây dựng.
b. Cơng thức tính
- Hiệu suất nạp dược chất (EE) được tính theo cơng thức: EE (%) = 100% - mRP tự do
mRP ban đầu x 100% - Khả năng nạp thuốc (LC) được tính theo cơng thức:
LC (%)= mRP ban đầu - mRP tự do
mRP ban đầu+ mlipid x100%
2.4.3.5. Đánh giá hình thái tiểu phân NLC-RP
Sử dụng kính hiển vi điện tử quét trường phát xạ (FESEM).
Ngun tắc: Trong cột chân khơng (p=1×10-7 Pa), các điện tử sơ cấp được tập trung lại và điều chỉnh hướng bằng các ống kính điện tử để tạo ra một chùm tia hẹp bắn phá vật liệu. Tại các điểm bị bắn phá phát ra các điện tử thứ cấp. Tốc độ và góc của các điện tử thứ cấp đại diện cho cấu trúc vật liệu được một dectector ghi lại và tạo
22
thành một tín hiệu điện tử. Tín hiệu này tiếp tục được khuếch đại và biến đổi thành hình ảnh quét hoặc một hình ảnh kỹ thuật số.
Mục đích: Quan sát hình thái tiểu phân NLC-RP.
Chuẩn bị mẫu: cho 1 giọt hỗn dịch NLC-RP lên đế carbon rồi đem sấy khô trong tủ sấy chân không LV 02040 Daihan Labtech. Mẫu sau đó được phủ một lớp Platin để tăng độ dẫn diện rồi đưa vào buồng chứa mẫu.
2.4.3.6. Đánh giá mức độ tái kết tinh của tiểu phân NLC-RP bằng phương pháp phân tích nhiệt quét vi sai DSC
a. Phương pháp phân tích nhiệt quét vi sai DSC
Nguyên tắc: Mẫu thử và mẫu đối chiếu được đặt trong buồng mẫu và gia nhiệt để chúng có cùng nhiệt độ. Sự chênh lệch nhiệt lượng cần thiết để duy trì nhiệt độ 2 mẫu bằng nhau cho biết thơng tin về q trình nhiệt của mẫu thử xảy ra trong thời gian quét. Nhiệt lượng chênh lệch này được xác định như một hàm của sự chênh lệch nhiệt độ tức thời giữa 2 mẫu. Khi có những thay đổi trong cấu trúc sẽ làm các q trình nhiệt bị thay đổi, điều đó được thể hiện bằng những thay đổi trên phổ đồ DSC.
Mục đích: Từ những sự thay đổi trên phổ đồ DSC, ta có thể tính tốn được mức độ tái kết tinh tương đối của lipid rắn trong tiểu phân NLC-RP.
Tiến hành: Cân chính xác khoảng 15-25 mg mẫu placebo không chứa dược chất và các mẫu thử (đã sấy khô trong tủ sấy chân không), cho vào chén nhôm chuẩn, đậy nắp và hàn vành nắp. Dùng kẹp đưa chén nhơm vào buồng máy có mẫu trắng là một chén nhôm trống. Tốc độ gia nhiệt 5oC/phút trong khoảng nhiệt độ quét từ 20-80oC, lưu lượng dịng khí N2 là 50ml/phút.
b. Cơng thức tính
Chỉ số tái kết tinh RI là phần trăm lipid rắn tái kết tinh liên quan đến nồng độ lipid rắn ban đầu [18].
RI (%)= ∆Hmẫu thử
∆Hmẫu placebo x Clipid x 100% Trong đó: Clipid là nồng độ của pha lipid.
2.4.3.7. Đánh giá khả năng thấm và lưu trữ trên da của NLC-RP bằng thử
nghiệm ex vivo
Tham khảo các tài liệu [14], [26], [70] xây dựng phương pháp đánh giá khả năng thấm và lưu trữ trên da của NLC-RP
Điều kiện thử:
- Thiết bị: hệ thống thử giải phóng qua màng Hanson Research.
- Màng khuếch tán: Da lưng lợn được loại lông và làm sạch lớp mỡ dưới da, dày khoảng 2 mm. Rửa bằng nước muối sinh lí và bảo quản ở 2-8oC trong 2 ngày.
23
- Môi trường khuếch tán: phối hợp dung dịch salin đệm phosphat pH 7,4 (gồm: 8,01 g NaCl + 0,2 g KCl + 3,58 g Na2HPO4.12H2O + 0,27 g KH2PO4 + nước tinh khiết vừa đủ 1000ml, điều chỉnh pH bằng NaOH hoặc HCl đến pH 7,4) và ethanol theo tỉ lệ 1:1 (v/v).
- Thể tích mơi trường thử: 7 ml; diện tích thử 1,767 cm2. - Nhiệt độ thử: 37±0,5oC.
- Tốc độ khuấy: 400 vòng/phút. - Khối lượng mẫu: khoảng 0,3 g. - Mẫu thử: hỗn dịch NLC-RP.
- Mẫu đối chiếu: bào chế theo công thức ở bảng 2.6.
Bảng 2.6. Công thức mẫu đối chiếu M0 trong đánh giá khả năng thấm và lưu trữ
Thành phần Retinyl palmitat Tween 20 Nước tinh khiết
Khối lượng (g) 0,2 0,2 9,6
a. Đánh giá khả năng thấm
Lấy 1ml dịch trong ngăn nhận, đem pha loãng đến nồng độ thích hợp bằng ethanol 96% và định lượng bằng quang phổ UV-VIS. Mẫu trắng là mẫu được xử lí tương tự với da lợn trong điều kiện thử nghiệm.
b. Đánh giá khả năng lưu trữ
Phần da lợn đóng vai trị màng khuếch tán giữa ngăn cho và ngăn nhận của hệ thống thử giải phóng qua màng Hanson Research được lấy ra sau 24 giờ và rửa sạch bằng dung dịch saline đệm phosphate pH 7,4 rồi thấm khô. Dùng kéo cắt nhỏ miếng da, cho vào ống ly tâm, thêm chính xác 3 ml ethanol 96%, đậy nắp kín, siêu âm 30 phút. Sau đó, đem li tâm trong máy siêu li tâm với tốc độ 15000 rpm trong 15 phút ở 20oC. Phần dịch thu được đem pha lỗng đến nồng độ thích hợp, lọc qua màng lọc cellulose acetat 0,45 μm để loại bỏ tạp chất. Định lượng bằng phương pháp đo quang, sử dụng mẫu trắng là mẫu được xử lí tương tự với da lợn.
Cơng thức tính lượng dược chất lưu trữ trên da: m = mRP
1,767
Trong đó: m là lượng dược chất lưu trữ trên da (μg/cm2) 1,767 là diện tích da lưu trữ dược chất (cm2)
2.4.3.8. Phương pháp đánh giá đặc tính bít giữ của gel chứa NLC-RP 1%
Đánh giá đặc tính bít giữ của gel chứa NLC-RP 1% thông qua chỉ số mất nước qua biểu bì TEWL. TEWL là chỉ số xác định lượng nước khuếch tán qua lớp sừng lên bề mặt da trong một đơn vị thời gian. Nước bốc hơi từ da được đo bằng cách sử dụng
24
một đầu dò được đặt tiếp xúc với bề mặt da và chứa các cảm biến phát hiện sự thay đổi mật độ hơi nước [2].
Tham khảo tài liệu [28], thiết kế thử nghiệm ex vivo đánh giá đặc tính sinh lí
của gel chứa NLC-RP 1%:
Tai lợn được rửa bằng nước muối sinh lí, lau khơ bằng khăn mềm. Các vùng da cịn ngun vẹn, khơng có vết thương hoặc vết xước có thể nhìn thấy được chọn và đánh dấu (1,5×1,5cm) và tính tồn vẹn của da được kiểm soát bằng cách đánh giá sự mất nước qua biểu bì. Chỉ những vùng da có giá trị TEWL<13 g/m2/h mới được đưa vào thử nghiệm. Các khu vực có giá trị TEWL>13 g/m2/h được coi là hàng rào bảo vệ da bị phá vỡ và do đó bị loại khỏi thử nghiệm. Sau đó, 0,2 g gel được bôi lên vùng da được chọn bằng găng tay và đánh giá sau 0, 3h, 7h bằng đầu TEWL của thiết bị nghiên cứu da DermaLab.