2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.4. Phương pháp xác định tác dụng hiệp đồng của tinh dầu và kháng sinh
2.3.4.1. Test Checkerboard – xác định tác dụng hiệp đồng
Test checkerboard đánh giá tác động giữa KS và TD trầu không thông qua việc xác định giá trị MIC 2 chiều, với MIC KS theo chiều ngang và MIC TD trầu không theo chiều dọc, cùng trên 1 đĩa 96 giếng. Chủng nghiên cứu, môi trường nuôi cấy và điều kiện thí nghiệm như test xác định MIC. Ở đĩa KS, dãy các nồng độ KS được chuẩn bị trong MHB, với nồng độ tương tự như bảng 2.5, mỗi giếng 50µl, thực hiện 02 đĩa độc lập. Ở đĩa TD trầu không, dãy các nồng độ TD được chuẩn bị trong MHB như trong hình 2.5, mỗi giếng 130µl. Sau đó, lấy 50µl từ đĩa TD trầu khơng cho vào cùng vị trí ở đĩa KS để thu được 100µl dung dịch kết hợp KS-TD trầu khơng, các giếng hàng A là KS riêng lẻ, các giếng cột 10 là TD trầu không riêng lẻ, cột 11 là chứng dương, cột 12 là chứng âm. Sau đó, 100 µl hỗn dịch VSV làm việc (xem phần MIC) được bổ sung vào tất cả các giếng (trừ cột 12, chứng âm). Mẫu được ủ và đọc như đánh giá MIC. Giá trị MIC của các mẫu dạng tự do (MIC KS, MIC TD trầu không) và dạng kết hợp (MIC KS- hỗn hợp, MIC TD trầu khơng-hỗn hợp) được sử dụng để tính tổng tỷ lệ nồng độ ức chế (FIC index- Fractional Inhibitory Concentration index)
𝑀𝐼𝐶 𝑋 ℎỗ𝑛 ℎợ𝑝
𝑀𝐼𝐶 𝑋 +
𝑀𝐼𝐶 𝑌 ℎỗ𝑛 ℎợ𝑝
𝑀𝐼𝐶 𝑌 = 𝐹𝐼𝐶 𝑋 + 𝐹𝐼𝐶 𝑌 = 𝐹𝐼𝐶 𝑖𝑛𝑑𝑒𝑥
Giá trị FIC index được sử dụng để đánh giá tương tác giữa các mẫu, với (i) FIC index nhỏ hơn 0,5 các mẫu sẽ có tác dụng hiệp đồng, (ii) FIC index từ 0,5 đến 4 các mẫu khơng có tác động qua lại hoặc chỉ có tác dụng cộng và (iii) FIC index > 4 tương ứng với tác dụng đối kháng giữa các mẫu thử.
21
Bảng 2.5. Mơ tả sắp xếp thí nghiệm tương tác tinh dầu - kháng sinh thông qua thử nghiệm checkerboard
KS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11(+) 12(-) A 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0 0 0 B 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0 0 0 C 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0 0 0 D 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0 0 0 E 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0 0 0 F 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0 0 0 G 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0 0 0 H 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0 0 0 TD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11(+) 12(-) A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 B 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0 0 C 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0 0 D 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 E 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 F 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 0 0 G 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 0 0 H 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 0 0
22
2.3.4.2. Phương pháp xây dựng đường cong nồng độ - đáp ứng
Đường cong nồng độ - đáp ứng được thực hiện với một dải nồng độ từ rất cao đến rất thấp, để có cái nhìn đầy đủ về dược lực học của KS cũng như sự kết hợp KS. Đường cong nồng độ - đáp ứng được thực hiện trong điều kiện tương tự khi thực hiện xác định MIC, trong môi trường MHB, trên đĩa 96 giếng. Hỗn dịch vi khuẩn nồng độ 1,5x106 được ủ với nồng độ khác nhau bổ sung hoặc không bổ sung tinh dầu trầu không với nồng độ quan sát thấy giá trị hiệp đồng tốt nhất. Hòa tan và pha lỗng dịch ni cấy đến nồng độ phù hợp trong PBS và cấy trải lên thạch TSA. Số lượng khuẩn lạc (colony- forming unit-CFU) được đếm sau khi ủ ở 37 °C trong vòng 24 giờ.
Sự thay đổi số lượng vi khuẩn trong các mẫu được so sánh với mẫu khởi điểm to. Các giá trị Emax và Cs được tính dựa trên phương trình hồi quy Hill-Langmuir từ đường cong nồng độ - đáp ứng trên phần mềm GraphPad 4.0. Giá trị Emax (Δlog10 CFU/ml) hiệu lực diệt khuẩn tối đa là sự biến đổi về số lượng VSV còn sống so với mẫu khởi điểm t0. Giá trị Cs (mg/l) là nồng độ KS thấp nhất, có khả năng ức chế sự phát triển của VSV.