2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.3. Phương pháp xác định hoạt tính diệt vi khuẩn tồn tại ở dạng dai dẳng
2.3.3.1. Phương pháp đánh giá khả năng diệt vi khuẩn dai dẳng
Thí nghiệm được thiết kế để làm với S. aureus ATCC 33591 và hai kháng sinh là meropenem, vancomycin.
Chuẩn bị hỗn dịch vi sinh vật 24 giờ: Chủng VSV được lấy từ ống Cryotube hoặc đĩa Petri. Cấy một que cấy hoặc 2-3 khuẩn lạc vào 5 ml MHB trong ống nghiệm. Ủ qua đêm, 370C trong máy lắc ổn định nhiệt. Sau đó pha lỗng 100 lần hỗn dịch VSV từ các ống được ủ qua đêm trong môi trường MHB. Đem ủ 24h, 370C trong máy lắc ổn định nhiệt để thu được hỗn dịch VSV 24 giờ. Q trình ni cấy 24 giờ này thúc đẩy một phần VSV chuyển đổi sang kiểu hình dai dẳng.
Chuẩn bị dung dịch kháng sinh, tinh dầu trầu khơng với nồng độ thích hợp (nồng độ tinh dầu được chuẩn bị tương tự như trong xác định MIC). Bảo quản 40C.
Thực hiện thí nghiệm trong các ống nghiệm lần lượt bổ sung kháng sinh, tinh dầu và hỗn dịch VSV 24 giờ: Sử dụng KS vancomycin 50 mg/l và meropenem 30mg/l đơn độc hoặc có kết hợp với tinh dầu 1 ml/l (¼ MIC) và sử dụng đơn độc tinh dầu trầu không nồng độ (¼ MIC và 8 MIC).
Đếm mẫu VSV khơng tiếp xúc với kháng sinh. Tính tốn nồng độ pha lỗng thích hợp. Đếm mẫu VSV có tiếp xúc với kháng sinh tại các thời điểm 1 giờ, 3 giờ, 5 giờ, 24 giờ. Tính tốn nồng độ pha loãng phù hợp. Ủ các mẫu cấy đếm sau 24 giờ. Đếm số khuẩn lạc.
Lượng VSV còn sống ở các thời điểm được tính tốn dựa trên số khuẩn lạc và nồng độ pha loãng và được biểu diễn dưới dạng log10 CFU/ml.
2.3.3.2. Phương pháp xác định khả năng diệt khuẩn trong biofilm
Phương pháp nuôi cấy tạo biofilm
Biofilm được tạo trên đĩa 96 giếng đáy bằng của SPL, sử dụng nồng độ vi khuẩn 0,005 ở OD620 nm (tương đương 107 CFU/mL), trong mơi trường ni cấy TGN (TSB có bổ sung NaCl và glucose), thể tích 200 μl/giếng, ủ ở 37°C trong 24 giờ.
Phương pháp đánh giá hoạt tính diệt khuẩn trong biofilm
Biofilm 24 giờ được sử dụng để đánh giá hoạt tính của tinh dầu trên đối tượng biofilm. Nghiên cứu được thực hiện với 3 đối tượng là (i) moxifloxacin, (ii) moxifloxacin kết hợp với tinh dầu trầu không nồng độ ¼ MIC và (iii) moxifloxacin kết hợp tinh dầu trầu khơng nồng độ 8 MIC. Trong đó moxifloxacin được sử dụng với một dãy nồng độ từ 0,001 đến 1000 mg/l. Cụ thể môi trường nuôi cấy sẽ được thay thế bằng TGN với vai trị mẫu chứng hay TGN có bổ sung kháng sinh, tinh dầu với vai trò mẫu thử. Biofilm này sẽ tiếp tục được ủ ở 37°C trong 24 giờ. Sau 24 giờ, định lượng VSV sống trong biofilm bằng phương pháp cấy đếm CFU trên đĩa thạch. Mẫu cần đếm số
20
lượng CFU sẽ được rửa nhẹ nhàng với PBS. VSV trong biofilm sẽ được phá ra khỏi biofilm bằng nước cất vô khuẩn, pipetting lên xuống tối thiểu 20 lần, sau đó sẽ được vortex thật kỹ hoặc siêu âm trong vịng 1 phút nếu cần để tách rời hồn toàn các khuẩn lạc. Mẫu sau đó sẽ được pha lỗng đến nồng độ phù hợp và cấy trải trên thạch TSA, ủ 24 giờ tại 37°C và đếm lượng khuẩn lạc. Lượng VSV cịn sống ở các thời điểm được tính tốn dựa trên số khuẩn lạc và nồng độ pha loãng. Kết quả được biểu diễn dưới dạng đường cong nồng độ (log mg/l) - đáp ứng (log CFU/ml) (xem mục 2.3.4.2).