CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
1.4.4.Kỹ thuật làm khô mẫu
Sau khi chiết mẫu cây bằng dung mơi, lọc, thu hồi dung mơi có được cao. Cao chiết này cần được sấy khơ vì các lí do sau:
- Các hợp chất ở trong cao sẽ ổn định và bền hơn nếu chúng hiện diện ở trạng thái khơ.
- Để tính đúng lượng cao chiết ra được so với mẫu cây khô ban đầu.
- Nếu mẫu là các hợp chất tinh khiết muốn đo các số liệu phổ thì mẫu cần được sấy khơ, nếu cịn lẫn vết nước, trên phổ đồ xuất hiện tín hiệu của nước gây khó khăn cho việc giải đốn cấu trúc.
Có nhiều phương pháp làm khơ mẫu, trong đó có:
- Sấy khơ bằng máy cơ quay chân khơng: khởi động máy cô quay chân không, cho mẫu vào cơ quay cho đến khi mẫu khơ hồn tồn.
- Sấy khơ bằng bình hút ẩm: mẫu cần làm khơ được đặt trong bình hút ẩm. Hợp chất được xem là khơ khi cân lần sau thì trọng lượng của mẫu khơng thay đổi so với lần cân trước đó.
1.4.5. Phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất
Sử dụng phương pháp xác định thành phần hóa học bằng Sắc kí khí ghép khối phổ GC – MS (Gas Chromatography Mass Spectroscopy).
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM
2.1. DỤNG CỤ VÀ HĨA CHẤT 2.1.1. Hóa chất
Bảng 2.1. Danh sách các hóa chất cần dùng trong quá trình thực nghiệm. St
t Tên hóa chất Hàm lượng Xuất sứ
1 Hexane 95% Trung Quốc
3 Chloroform 95% Trung Quốc
4 Ethyl acetate 97% Trung Quốc
5 Methanol 97% Trung Quốc
6 Acetone 95% Trung Quốc
7 Acid Sufuric 5% Trung Quốc
8 Nước cất 100% Trung Quốc
9 Bản mỏng sắc ký Merck
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ
- Tủ sấy.
- Máy cô quay chân không.
- Đèn UV ở 2 bước sóng 254 nm và 365 nm. - Cân phân tích và cân kỹ thuật.
- Kính, ly,bút chì,thước kẻ, bơng gịn.
- Ống vi quản.
- Các dụng cụ thơng thường dùng để ly trích như: bình tam giác, cốc thủy tinh, ống nghiệm, bình cơ quay, ống đong, …
2.2. THỰC NGHIỆM
Quá trình tạo các cao chiết phân bố được tiến hành theo phương pháp bao gồm chiết rắn - lỏng. Phương pháp này được thể hiện bằng sơ đồ sau:
Quá trình phân lập hợp chất từ cao chiết ethyl acetate được thể hiện dưới đồ sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.1. Thu lấy mẫu
Thu mua 4 kg mẫu tại huyện Cưkuin, tỉnh Đăk Lăk.
Hình 2.1. Mẫu sau khi thu hái.
2.2.2. Xử lí mẫu và ngâm chiết
Mẫu thực vật sau khi thu hái về được rửa sạch, loại bỏ phần hư hỏng, phơi khơ và xay nhỏ.
Hình 2.2. Mẫu sau khi cắt và phơi khơ. Hình 2.3. Mẫu sau khi nghiền nhỏ.
Sau khi nghiền nhỏ mẫu, đem mẫu đi ngầm dầm với dung môi hexane ở nhiệt độ phịng. Ngâm dầm mẫu trong dung mơi hexane với thời gian 5 ngày, trung bình 5 tiếng thì khuấy đều hỗn hợp dung mơi và mẫu 1 lần. Sau 5 ngày, lọc hỗn hợp dung môi và mẫu, ta thu được dịch chiết hexane và bã hexane. Cô quay chân không dịch chiết hexane thu được cao hexane.
Tiếp tục lấy bã hexane đi ngâm dầm với dung môi ethyl acetate ở nhiệt độ phòng, trong thời gian 5 ngày, cứ 5 tiếng thì khuấy đều hỗn hợp gồm dung mơi và
Hình 2.4. Mẫu ngâm trong ethyl acetate. Hình 2.5. Dịch chiết ethyl acetate.
Đuổi kiệt dung môi trong dịch chiết ethyl acetate bằng máy cô quay chân không, thu được cao ethyl acetate và dung mơi thu hồi ethyl acetate.
Hình 2.6. Cơ quay dịch chiết ethyl acetate.
Hình 2.7. Cao ethyl acetate. Hình 2.8. Dung mơi ethyl acetate thu hồi.
Lượng cao chiết hexane thu được là 21g và lượng cao chiết ethyl acetate là 50g.
2.2.3. Phân lập hợp chất từ cao chiết ethyl acetate
2.2.3.1. Chọn hệ dung môi rửa giải bằng phương pháp sắc ký bản mỏng TLC
Lấy 0,1g cao ethyl acetate hòa tan vừa đủ với một lượng acetone.
Hình 2.9. Cao chiết ethyl acetate hòa tan trong acetone.
Sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng và soi trên máy UV với bước sóng 254nm và 365nm. Sau đó nhúng bản mỏng vào dung dịch acid H2SO4 10% và nung trên bếp nung ở nhiệt độ 1000C.
Quy trình chấm bản mỏng:
- Chuẩn bị ống vi quản: ống thủy tinh có đường kính trong ống nhỏ, khoảng 1-2 mm, một đầu được vót nhọn, dài 10-20 cm.
- Chuẩn bị tấm bản mỏng: Từ tấm bản mỏng 20x20, dùng kéo cắt các bản có kích thước cần thiết. Lưu ý sao cho tấm bản mỏng phải lọt vào bình giải ly,
- Dùng bút chì để vạch nhẹ các nét mức xuất phát và mức tiền tuyến dung môi.
- Chuẩn bị dung dịch mẫu: Chất lỏng có thể chấm trực tiếp mẫu lên bản mỏng, dung dịch quá sệt có thể pha lỗng mẫu, chất rắn phải hịa tan trong dung môi hữu cơ phù hợp, nồng độ 2-5%.
- Giải ly bình giải ly bản mỏng: chuẩn bị bình có kích thước lớn hơn một chút so với kích thước của bản mỏng.
- Hiện hình các vết sau khi giải ly: Các hợp chất có màu sẽ được nhìn thấy bằng mắt thường, nhưng phần lớn các hợp chất hữu cơ khơng có màu, nên nếu muốn nhìn thấy các vết, cần sử dụng phương pháp vật lí (bằng tia tử ngoại UV).
Bảng 2.2. Hệ dung môi giải ly bản mỏng.Hệ dung môi Tỉ lệ Hệ dung môi Tỉ lệ HA 3:2 HE 5:2 CE 3:2 CA 2:2 CM 3:2 2.2.3.2. Sắc ký cột
Lấy 49,9g cao chiết ethyl acetate trộn với một lượng vừa đủ silicagel Merck, khuấy đều và liên tục cho tới khi hỗn hợp thành dạng bột khơ. 105g bột silicagel có tẩm dịch chiết được đưa lên cột sắc ký đường kính 3 cm. Cột sau khi đã tương đối ổn định, hỗn hợp bột silicagel và cao chiết ethyl acetate được đưa lên đầu cột, với hệ dung mơi ban đầu là hexane : acetone (3:2). Sau đó xả hệ dung mơi hexane : acetone (3:2) và thu được 100ml hệ dung môi trên. Tiếp tục với hệ dung môi rửa giải là hexane : acetone (3:2,5). Dịch giải ly từ cột sắc ký được hứng vào các ống nghiệm lớn (dung tích 50ml) có đánh số. Dùng sắc ký bản mỏng và đèn UV hai bước sóng để kiểm tra phần dịch thu được, những phần giống nhau gom lại thành một phân đoạn.
(a) (b)
Hình 2.10. Cột sắc ký lúc vừa cho cao chiết (a) và lúc đang chạy dung môi (b). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiếp tục với hệ dung môi rửa giải hexane : acetone (3:3). Dịch giải ly được hứng vào các ống nghiệm lớn được đánh số. Dùng sắc ký bản mỏng và đèn UV hai bước sóng để kiểm tra phần dịch thu được, những phần giống nhau gom lại thành một phân đoạn.
Với hệ dung môi rửa giải hexane : acetone (3:3,5). Dịch giải ly được hứng vào các ống nghiệm lớn được đánh số. Dùng sắc ký bản mỏng và đèn UV hai bước sóng để kiểm tra phần dịch thu được, những phần giống nhau gom lại thành một phân đoạn.
Tiếp tục với hệ dung môi rửa giải hexane : acetone (3:4). Dịch giải ly được hứng vào các ống nghiệm lớn được đánh số. Dùng sắc ký bản mỏng và đèn UV hai bước sóng để kiểm tra phần dịch thu được, những phần giống nhau gom lại thành một phân đoạn.
Tiếp tục với hệ dung môi rửa giải hexane : acetone (3:4,5). Dịch giải ly được hứng vào các ống nghiệm lớn. Dùng sắc ký bản mỏng và đèn UV hai bước sóng để kiểm tra phần dịch thu được.
2.2.3.3. Thu cao chiết của từng phân đoạn
Cô quay chân không dịch chiết của từng phân đoạn, thu được cao chiết của từng phân đoạn.
2.2.3.4. Xác định thành phần hóa học của cao chiết phân đoạn
Lấy 1g cao chiết ethyl acetate ở phân đoạn 1 để xác định thành phần hóa học bằng phương pháp Sắc kí khí ghép khối phổ GC – MS (Gas Chromatography Mass Spectroscopy).
Mẫu được gửi đến Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường chất lượng 2 tại địa chỉ 02 Ngô Quyền, quận Sơn Trà, thành phố Đà Nẵng.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ CHỌN HỆ DUNG MÔI RỬA GIẢI
Bảng 3.1. Kết quả chạy sắc ký bản mỏng TLCST ST T Hệ dung mơi Tỉ lệ Bước sóng 254 nm
Bước sóng 365 nm Sau khi nhúng acid H2SO4 10% rồi hơ
nóng
1 HA 3:2
2 HE 5:2
3 CE 3:2
5 CM 3:2
Nhận xét: Sau khi soi bản mỏng trong các bước sóng khác nhau (254nm và
365nm) và hiện hình bằng dd H2SO4 10% thì thấy trên bản mỏng với hệ dung môi
hexane : acetone (3:2) xuất hiện các vệt chất cao bằng
2
3 bản mỏng, rõ ràng hơn so với hệ hexane : ethyl acetate (5:2), các hệ dung mơi cịn lại tuy cho các vệt rõ hơn nhưng quá cao nên chúng tôi chọn hệ hexane : acetone để làm dung mơi rửa giải trong q trình sắc ký cột.
3.2. KẾT QUẢ SẮC KÝ CỘT
Với hệ dung môi rửa giải là hexane : acetone (3:2,5). Thu được kết quả sắc ký bản mỏng TLC như sau:
Hình 3.1. Kết quả sắc ký bản mỏng TLC của các ống nghiệm 1-8 với hệ dung môi giải ly HA (3:2,5).
Nhận xét: Các vết của các ống nghiệm từ 1 đến 3 giống nhau nên được gom
lại lại thành phân đoạn 1, các vết của ống nghiệm từ 4 đến 8 giống nhau nên được gom lại thành phân đoạn 2.
Hình 3.2. Kết quả sắc ký bản mỏng TLC của các ống nghiệm 9-16 với hệ dung môi giải ly HA (3:3).
Nhận xét: Dựa vào kết quả trên, thấy các vết của các ống nghiệm từ 9 đến 16 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
giống nhau nên được gom lại thành phân đoạn 3.
Với hệ dung môi rửa giải hexane : acetone (3:3,5). Kết quả sắc ký bản mỏng TLC với phần dịch của hệ dung mơi rửa giải trên được thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3. Kết quả sắc ký bản mỏng TLC của các ống nghiệm 17-24 với dung môi giải ly HA (3:3,5).
Nhận xét: Kết quả sắc ký bản mỏng TLC cho thấy vết của các ống nghiệm
được đánh số từ 17 đến 24 giống nhau nên được gom lại thành phân đoạn 4.
Với hệ dung môi rửa giải hexane : acetone (3:4). Kết quả thu được 2 phân đoạn là phân đoạn 5 gồm các vết của các ống nghiệm số 25-29 giống nhau và phân đoạn 6 gồm các ống nghiệm số 30-32 có các vết giống nhau. Được thể hiện ở hình 3.4 dưới đây:
Hình 3.4. Kết quả sắc ký bản mỏng TLC của các ống nghiệm 25-32 với hệ dung môi giải ly giải HA (3:4).
Với hệ dung môi rửa giải hexane : acetone (3:4,5). Dịch giải ly được hứng vào các ống nghiệm lớn. Dùng sắc ký bản mỏng và đèn UV hai bước sóng để kiểm tra phần dịch thu được và nhận thấy các vết trên bản mỏng rất mờ nên dừng việc sắc ký cột.
3.3. KẾT QUẢ THU LẤY CAO CHIẾT CỦA TỪNG PHÂN ĐOẠN
Sau khi cô quay chân không dịch chiết của từng phân đoạn, thu được cao chiết từng phân đoạn dưới đây.
(a) (b) (c)
Hình 3.5. Cao chiết phân đoạn 1 (a), cao chiết phân đoạn 2 (b) và cao chiết phân đoạn 3 (c).
(d) (e) (f)
Hình 3.6. Cao chiết phân đoạn 4 (d), cao chiết phân đoạn 5 (e) và cao chiết phân đoạn 6 (f).
Khối lượng của các cao chiết phân đoạn được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.2. Khối lượng cao chiết của từng phân đoạn.
3.4. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA CAO CHIẾTPHÂN ĐOẠN PHÂN ĐOẠN
Hình 3.7. Phổ GC-MS của cao chiết ethyl acetate phân đoạn 1 của rễ cây ba kích.
Từ sơ đồ phổ và kết hợp vời tài liệu số [16] chúng tơi giải đốn ra bảng sau:
Bảng 3.3. Các hợp chất có trong cao chiết ethyl acetate phân đoạn 1 của rễ cây ba kích.
STT Tên các hợp chất
Công thức cấu tạo Hàm
lượng (%)
2 endo-Borneol 0,88
3 Benzoic acid 0,41
4 Triacetin 2,39
5 Dibutylphthalate 5,50
6 acid, ethyl esterHexadecanoic 3,76
7 Anthracenedione9,10- , 2-methyl- 1,61 8 Linoleic acid ethyl ester 1,74 9 Ethyl oleate 1,68
10 acid, ethyl esterOctadecanoic 0,63 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
11 9,10- Anthracenedione , 2-hydroxy-1- methoxy- - 6,48 12 Octadecenamide9- , (Z)- 4,51
13 Bis(2- ethylhexyl)phtha late 4,85 14 Squalene 0,29 15 Campesterol 4,07 16 Stigmasterol 5,17 17 Sitosterolgamma- 17,64 18 Stigmasta-3,5-diene 1,90
Kết luận: Qua kết quả GC- MS, nhận thấy rễ cây Ba Kích có những thành
phần chính: Anthraquinon (cơng thức số 7,11); Triterpen (cơng thức số 15, 16, 17, 18); Ester của acid hữu cơ (công thức số 5, 6, 8, 9, 10, 13); Ngồi ra cịn có các thành phần khác như alcohol (cơng thức số 1, 2), acid hữu cơ (công thức số 3), amide (công thức số 12) nhưng hàm lượng không đáng kể.
Tơi đã tìm thêm được một số hợp chất khơng có trong kết quả đo dịch chiết rễ cây Ba Kích cao chiết ethyl acetate trong khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu xác định thành phần hóa học cao chiết ethyl acetate rễ cây Ba Kích (Morinda
officinalis) ở Đắk Lắk” của bạn Huỳnh Thị Thuận lớp Sư phạm Hóa K16. Đó là
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
1. KẾT LUẬN
Qua nội dung của chuyên đề này, chúng tơi thực hiện được những cơng việc chính sau:
1. Chúng tơi đã tổng quan được loài Morinda officinalis là một loài thân gỗ thuộc chi Morinda L., họ Cà phê được tìm thấy chủ yếu ở khu vực các nước châu Á và châu Phi, đã được nghiên cứu ở một số khu vực, nhưng ở Việt Nam chưa có cơng bố chính thức về lồi này.
2. Từ 4.0 kg mẫu rễ cây Ba kích chúng tơi đã tạo được 50 g cao chiết ethyl acetate. Từ 49,9 g cao chiết ethyl acetate sử dụng dung mơi thích hợp và phương pháp phân lập truyền thống là sắc ký bản mỏng và sắc ký cột, đã thu được cao chiết của sáu phân đoạn lần lượt là 4,02 g; 4,19 g; 4,55 g; 3,98 g và 3,15 g.
3. Từ dữ liệu phổ GC- MS chúng tôi xác định được 18 thành phần hóa học có trong cao chiết ethyl acetate phân đoạn 1 của rễ Ba kích.
2. ĐỀ XUẤT
1. Thử nghiệm các hoạt tính sinh học của các cao chiết và chất phân lập được để đạt được các kết quả nghiên cứu một cách hệ thống và đầy đủ tạo ý nghĩa về mặt khoa học.
2. Tiếp tục phân lập các hợp chất khác trong các phân đoạn khác.
3.Thực hiện các nghiên cứu trên những bộ phận cịn lại của cây Ba kích. 4. Nhân giống và mở rộng diện tích trồng cây Ba kích để bảo tồn và phát triển.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu Tiếng Việt
[1].Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập 1, NXB. Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, 101 – 106.
[2]. Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, 243 – 244.
[3]. Nguyễn Tiến Bân (2003), Danh lục các loài thực vật Việt Nam, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
[4]. Nguyễn Chiều (2001), Kết quả bước đầu nghiên cứu trồng Ba kích ở Phú Thọ, Tạp chí Dược học số 1, trang 6.
[5]. Nguyễn Chiều, Lê Thanh Sơn, 2008. Những kết quả về nghiên cứu kỹ thuật
nhân giống và trồng vườn giống ba kích (Morinda officinalis How) trong mơ hình vườn gia đình, vườn trang trại Morinda officinalis. Cơng trình NCKH tạo nguồn
nguyên liệu làm thuốc, 1998- 2008.
[6]. Dương Thị Hương, Trịnh Thị Kim Anh, Nguyễn Thị Hải Hà (2009), Bước đầu
đánh giá hoạt tính androgen của rễ cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia J.) trên chuột thực nghiệm, Tạp chí Dược học, số 49, 16-20.
[7]. Nguyễn Mạnh Quân, Nguyễn Trần Giáng Hương (2008), Nghiên cứu tác dụng
của Ba kích (Morinda officinalis How) lên sự phát triển của cơ quan sinh dục chuột cống đực, Tạp chí nghiên cứu Y học, số 53(1), 77-84.
[8]. Nguyễn Thanh Tùng, Nguyễn Trần Thị Giáng Hương, Nguyễn Kiều Vân (2008), Nghiên cứu tác dụng của thung dung (Cistanche deserticola Y.g. Ma) trên (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
chức năng sinh sản của chuột cống đực non, Tạp chí Dược học, số 8, 18-22.
[9]. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, chuyên luận dược liệu Ba kích. Nhà xuất bản Y học, 682-683.
[10].Vũ Đức Lợi, Nguyễn Tiến Vững, Nguyễn Thị Thúy An (2016),Một số hợp
chất phân lập từ rễ cây ba kích (Morinda officinalis How.) trồng ở tỉnh Quảng Ninh. Tạp chí Dược học, 56 (9).
[11]. Trần Mỹ Tiên, Nguyễn Mai Thanh Tâm, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương (2012), Nghiên cứu tác dụng hướng sinh dục nam của cây Ba kích (Morinda
[12]. Lê Văn Đăng (2005), Chuyên đề một số hợp chất thiên nhiên, NXB ĐHQG TPHCM.
[13]. Nguyễn Hữu Đỉnh, Trần Thị Đà (1999), Ứng dụng một số phương pháp phổ
nghiên cứu cấu trúc phân tử, NXB Giáo dục.