màu với thuốc thử Folin- Ciocalteau.Dựa vào đồ thị chuẩn định lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của
Enzyme.Hoạt động của chế phẩm được biểu diễn bằng đơn vị hoạt độ enzyme protease. bằng đơn vị hoạt độ enzyme protease.
-Một đơn vị hoạt độ enzyme protease là lượng enzyme trong 1 phút ở 30oC,pH thích hợp có thể thủy phân protein (casein hoăc Hb) tạo thành các sản phẩm hòa tan trong
TCA (tricloacetic acid) và cho phản ứng màu với thuốc thử Folin-Ciocalteau tương đương với 1 µmol tyrozin .
Cách pha dung dịch tiêu chuẩn Tyrosin (1µmol/1ml) -Cân chính xác 18,12mg tyrosin tinh khiết, khô hòa tan trong dd HCl 0,2N .
-Cho vào bình định mức 100ml và thêm vào HCl 0,2N vào cho tới vạch định mức.
-Từ dung dịch này pha loãng tiếp tục bằng dd HCl 0,2N để nhận được dd có chứa 0,01µmol/ml đến 0,05µmol/ml.
Lập đồ thị tiêu chuẩn Tyrosin:
• Từ dung dịch đã pha loãng trên, lấy 1ml cho vào
ống nghiệm,thêm 5ml dd Na2CO3 0,4M lắc đều, thêm 1ml Folin đã pha loãng 5 lần.Để 30’ ở nhiệt thêm 1ml Folin đã pha loãng 5 lần.Để 30’ ở nhiệt độ phòng và so màu bằng máy so màu
• Vẽ đồ thị chuẩn: trục hoành ghi số µmol
Tiến hành
• Lấy 2 ống nghiệm (1 ống thí nghiệm,1 ống kiểm tra).
ống thí nghiệm:
• 1ml enzyme protease (30oC),1ml dd cơ chất (30oC ) giữ đúng10 phút ở 30oC .cho ngay 5ml TCA 5%lắc đều ,giữ 30 phút ở 30oC .
• Lọc ,lấy 1ml dịch lọc cho vào ống nghiệm khác .thêm
vào 5ml dd Na2CO3 0,4M lắc đều,thêm 1ml thuốc thử folin (pha loãng 5 lần),lắc đều,giữ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
ống kiểm tra:
• Cho 2ml dd cơ chất (30oC), cho 5ml dd TCA5% lắc đều rồi cho 1ml dd enzyme .các giai đoạn tiếp theo làm tương tự ống thí nghiệm.
Tính kết quả:
• Lấy số liệu đọc trên máy của mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm tra.Dựa
vào đồ thị tiêu chuẩn tính lượng µmol tương ứng.
• Số đơn vị hoạt độ(HP) của 1ml dịch enzyme được tính:
• Trong đó: