V. CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT
5.1. Một số vấn đề chung về chuyển gen ở thực vật.
Chuyển gen ở thực vật đã phát triển cùng với sự phát triển của các kỹ thuật nuơi cấy mơ và tế bào thực vật. Nĩ trở thành một phương tiện quan trọng để nghiên cứu cơ bản trong sinh học thực vật. Nĩ cho phép nghiên cứu cấu trúc và điều khiển hoạt động của gen. Ngồi ra nĩ mở ra triển vọng chuyển các gen cĩ ý nghĩa kinh tế vào cây trồng. Từ khi khám phá ra rằng chuyển gen cĩ thể thực hiện nhờ Agrobacterium tumefaciens (Klee & Rogers, 1989) các nhà khoa học tin rằng Arobacterium cĩ thể chuyển gen vào tất cả các lồi cây. Nhưng sau đĩ kết quả thực tế cho thấy chuyển gen bằng Agrobacterium khơng thể thực hiện được trên các cây ngũ cốc vì thế hàng loạt các kỹ thuật chuyển gen đã được phát triển đĩ là kỹ thuật chuyển gen trực tiếp (Paszkowski & cs, 1989), kỹ thuật bắn gen (Klein & cs, 1989), kỹ thuật vi tiêm (Neuhaus & cs, 1987), kỹ thuật chuyển gen qua hạt phấn (Hess & cs, 1977 ; Ohta, 1986), kỹ thuật đường dẫn bằng ống phấn (Luo & cs, Wu, 1988), kỹ thuật ủ hạt hoặc mơ với ADN (Ledoux & cs, 1974), kỹ thuật nhiễm vi
khuẩn (Grimsley & cs, 1986), sử dụng ADN của virus (Gronenborn & Matzeit,1989), Kỹ thuật điện di (Linsay & Jones, 1990), dung hợp liposom (Ahokas, 1987), phương pháp vi tiêm (De la Pena & cs, 1987), và phương pháp xử lý laser (Weber & cs, 1988). Đến nay nhờ cải tiến các vectơ chuyển gen nên kỹ thuật chuyển gen bằng A. tumefaciens đã thành
cơng cả ở cây ngũ cốc đặc biệt là lúa (Hiei và cs, 1994). Kỹ thuật này trở nên một kỹ thuật đầy triển vọng đối với chuyển gen ở thực vật.
Chuyển gen được thực hiện qua các bước sau: - Xác định gen liên quan đến tính trạng quan tâm. - Phân lập gen.
- Gắn gen vào các vectơ biến nạp. - Biến nạp vào E. Coli.
- Tách ADN plasmid.
- Biến nạp vào mơ hoặc tế bào thực vật. - Chọn các thể biến nạp.
- Tái sinh cây biến nạp.
- Chứng minh sự cĩ mặt của gen biến nạp trong cây tái sinh.
Khi đặt ra mục đích và thực hiện thí nghiệm chuyển gen cần chú ý một số vấn đề sinh học của hệ thống chuyển gen như:
- Khơng phải tồn bộ tế bào đều thể hiện tính tồn năng.
- Cây biến nạp chỉ cĩ thể tái sinh từ các tế bào cĩ khả năng tái sinh và khả năng thu nhận gen biến nạp vào genơm.
- Mơ thực vật là hỗn hợp các quần thể tế bào cĩ những khả năng khác nhau. Cần xem xét một số vấn đề như: chỉ cĩ số ít tế bào cĩ khả năng tái sinh và biến nạp; một số khác cĩ một trong hai khả năng; một số nếu tạo điều kiện phù hợp thì trở nên cĩ khả năng; một số khác hồn tồn khơng cĩ khả năng tái sinh và biến nạp.
- Thành phần các quần thể tế bào được xác định bởi lồi, kiểu gen, từng cơ quan, từng giai đoạn phát triển của mơ và cơ quan.
- Cho đến nay gen chỉ cĩ thể chuyển vào tế bào cĩ thành xellulơ bằng
Agrobacterium, virus, vi tiêm, bắn gen và chuyển gen trực tiếp.
Khả năng xâm nhập của gen vào genơm một cách ổn định khơng tỷ lệ với sự thể hiện tạm thời của gen.
Các ADN khơng phải là của virus khi cĩ trong genơm chưa bảo đảm là đã gắn ổn định với genơm.
- Các ADN khơng phải của virus khơng chuyển rời từ tế bào nọ sang tế bào kia, nĩ chỉ ở nơi mà nĩ được đưa vào.
- ADN virus khơng xâm nhập vào genơm cây chủ, chuyển từ tế bào này sang tế bào khác và bị loại ở mơ phân sinh.