2 1 Khái niệm đột biến
223 Phương pháp gây đột biến nhân tạo
2 2 3 1 Đặc điểm của phương pháp gây đột biến
Các kết quả nghiên cứu cho thấy tần số đột biến và các đặc điểm đột biến phụ thuộc vào tác nhân gây đột biến được dùng để xử lý cũng như phụ thuộc vào đặc điểm di truyền của chúng Vì lý do đó việc lựa chọn nguồn vật liệu khởi đầu cũng như tác nhân gây đột biến có ý nghĩa quyết định sự thành bại của cơng việc
Xử lý đột biến vào lúc hạt nảy mầm, cây con cho hiệu quả cao hơn so với xử lý lúc hạt ở trạng thái nghỉ và cây trưởng thành Xử lý tế bào ở thời kỳ phân bào giảm nhiễm dễ phát sinh đột biến hơn ở các thời kỳ khác Xử lý giai đoạn tiền phôi cho tần số đột biến cao nên được phổ biến rộng
2 2 3 2 Các tác nhân gây đột biến
Có 2 tác nhân gây đột biến chính là tác nhân lý học và tác nhân hóa học - Tác nhân vật lý: Có thể liệt kê như sau: tia X, tia γ, bức xạ cực tím ion, nhiệt độ…
- Tác nhân hóa học: gồm những hóa chất gây đột biến phổ biến như: EMS, NEU, NMU…
2 2 3 3 Một số vấn đề về ứng dụng gây đột biến thực nghiệm trong chọn giống
Theo Nguyễn Hồng Minh (1999) khi xử lý đột biến trong chọn giống sẽ xảy ra một số trường hợp:
Thứ nhất: Các dòng tự thụ phấn đem xử lý thường có mức đồng hợp tử cao
Đột biến thường chỉ xuất hiện ở một điểm ở một nhiễm sắc thể của đôi tương đồng Sự tổ hợp của các nhiễm sắc thể thông qua tự thụ phấn dễ dàng xuất hiện các kiểu phân ly đồng hợp tử Như vậy, ở các đời tự thụ ta có thể chọn lọc được thể đột biến ổn định đối với tính trạng đơn gen Từ đó chúng có thể tìm ra kiểu
có ý nghĩa về mặt nơng học, hoặc là gen chỉ thị có giá trị trong phân tích trong phân tích di truyền và trong chọn giống
Thứ hai: Đối với những tính trạng đa gen, hiệu quả thể hiện đột biến phần
lớn có liên quan tới sự biến đối ở nhiều locus khác nhau Trong đó có thể thu được kiểu tương tác mới có hiệu quả dương tính, dẫn tới sự thể hiện của tính trạng vượt hơn mức khởi thuỷ Tuy nhiên, quá trình tái tổ hợp các nhiễm sắc thể xảy ra trong giảm phân sẽ dẫn tới sự sắp xếp lại các tổ hợp gen ở các thế hệ tự thụ Sự kiện này làm thay đổi hiệu quả tương tác, về cơ bản, gây ra sự giảm dần mức thể hiện của tính trạng, trở về trạng thái khởi thuỷ của nó sau một số lượng đời nhân nào đó bằng tự thụ phấn (trong đó có loại trừ những kiểu phân ly suy thoái)
Thứ ba: Một khả năng hiếm hơn có thể xảy ra, đó là một thể đột biến đơn
thu được (Ổn định qua các thế hệ tự thụ), hoạt động của nó có ảnh hưởng dương tính tới thể hiện của một tính trạng số lượng có ý nghĩa về mặt nơng học Ở trường hợp (hiếm) này có thể thu được dạng có tính trạng số lượng cải tiến ổn định qua các thế hệ tự thụ phấn
Thứ tư: Theo đặc điểm thể hiện đột biến đối với các tính trạng số lượng
(ghi ở điểm 2), ta có thể rút ra bài tốn ứng dụng ở đây đối với cây nhân giống qua tự thụ phấn là: Phần lớn giống chọn lọc đột biến cải tiến theo tính trạng số lượng thường có thời gian (số đời nhân) sử dụng ngắn (ngắn hơn nhiều so với giống chọn lọc theo tái tổ hợp)
Thứ năm: Ở cây trồng, những dạng đột biến có ý nghĩa về mặt nơng học
thường thu được như: Rút ngắn thời gian sinh trưởng, thu được dạng lùn có năng suất đảm bảo, nhiều tính trạng liên quan đến chất lượng tiêu dùng Để cải tiến cây trồng theo hướng tăng khả năng chống chịu với các tác động bất lợi của ngoại cảnh thì phương pháp gây đột biến nhân tạo cho hiệu quả kém
2 2 4 Lịch sử phát triển của chọn tạo giống lúa bằng phương pháp đột biến
Lịch sử của đột biến bắt đầu từ khoảng 300 trước công nguyên, đột biến được Hugo De Vries sử dụng đầu tiên năm 1901 Đến năm 1927 Muller đã chứng minh đột biến có thể được gây ra một cách nhân tạo Năm 1928, Stadler mô tả hiệu ứng gây đột biến của tia X và tia gamma trên lúa mạch, ngô và lúa mỳ Đây là cơng trình nền tảng, mở đầu cho khoa học chọn tạo giống cây trồng bằng đột biến (Vũ Văn Liết & cs , 2013)
Bảng 2 1 Quá trình hình thành và phát triển đột biến ở lúa trên thế giới
Nguồn: IAEA (2019)
2 3 CƠ SỞ KHOA HỌC PHÁT SINH ĐỘT BIẾN PHÓNG XẠ
Hugo De Vries sử dụng đầu tiên năm 1901, tác giả này cho rằng: di truyền có thể bị thay đổi bởi một cơ chế khác với sự tái tổ hợp Tuy nhiên, người sáng lập đột biến là Muller (Kamile & Ayse, 2015) Năm 1927, Muller chứng minh hiện tượng đột biến có thể gây ra một cách nhân tạo, ơng đề nghị chiếu xạ (tia X) để gây đột biến nhân tạo trong công tác chọn tạo giống cây trồng Năm 1928, Stadler mô tả hiệu ứng gây đột biến của tia X và tia gamma trên lúa mạch, ngô và lúa mỳ (Vũ Văn Liết & cs , 2013)
Năm Sự kiện
1927 Muller đã chứng minh đột biến có thể được gây ra một cách nhân tạo 1928 Stadler mô tả hiệu ứng gây đột biến của tia X và tia gamma trên lúa mạch,
ngô và lúa mỳ
1957 Trung Quốc công bố 3 giống lúa đột biến đầu tiên là: KT 20-74 (Keh-tze 20-74), SH 30-21và Shuangchiang 30-21
1977 Giống lúa đột biến đầu tiên được thương mại tại Mỹ 1990 T-ADN được chèn và biểu hiện thành công trong cây lúa
1993 Phần tử tự trị Ac trong hệ thống chuyển vị của ngô, được đưa vào hệ gen của cây lúa
1996 Sử dụng thành công retrotransposon để gây đột biến ở lúa
2002 Các giống lúa kháng thuốc trừ cỏ Imidazolinone được đưa vào sử dụng, dự thảo
trình tự bộ gen của japonica và indica lần đầu tiên xuất hiện (Một trong những giống lúa đột biến đã tạo ra cuộc cách mạng hóa Nơng nghiệp ở Hoa Kỳ) 2005 Trình tự bộ gen lúa hồn chỉnh dựa trên bản đồ di truyền được công bố và
trở thành tiêu chuẩn vàng của bộ gen cây trồng
2013 Hệ thống chỉnh sửa CRISPR/Cas được đưa vào sử dụng để chỉnh sửa gen mục tiêu ở lúa
2019 823 giống lúa đột biến được đăng ký chính thức kể từ khi giống lúa đột biến đầu tiên được tạo ra và phát triển ở Trung Quốc năm 1957
Trần Duy Quý & cs (2009) cho rằng chọn giống đột biến tạo ra sự đa dạng về di truyền của vật liệu khởi đầu nhanh và hiệu quả, chỉ làm thay đổi một hoặc một vài tính trạng mà khơng làm ảnh hưởng tới những tính trạng khác của cây trồng Đồng quan điểm, Shua & cs (2012),cho rằng đột biến thực nghiệm có thể làm xuất hiện một đặc tính hồn tồn mới một cách tức thời từ giống đã có mà khơng làm ảnh hưởng đến các đặc tính khác của giống Chính vì vậy, đột biến thực nghiệm đang được áp dụng rộng rãi trong chọn tạo giống cây trồng bằng xử lý tác nhân vật lý (tia gamma, rơnghen, alpha, beta,…), hóa học (các hợp chất alkyl hóa, các đồng đẳng của base nitơ…)
2 3 1 Tác nhân phóng xạ gây đột biến
2 3 1 1 Nhóm phóng xạ ion hóa
Là loại phóng xạ gây ra các phản ứng phóng xạ, tạo ra các cặp ion hóa trong mơi trường mà chúng xâm nhập hoặc gây ra sự kích động phân tử, được chia thành hai nhóm phụ: nhóm bức xạ hạt và nhóm bức xạ sóng điện từ (Lê Duy Thành, 2001)
a Bức xạ hạt
Là những dòng nguyên tử và hạt sơ cấp chuyển động với tốc độ thay đổi, được đặc trưng bằng khối lượng điện tích và tốc độ, được chia thành 3 nhóm: Nhóm hạt sơ cấp nhẹ, những dịng điện tử, pozitron; Nhóm hạt nặng mang điện tích: proton, detron, α (proton – hạt cơ bản bền vững, m = 1836 e, điện tích e+; detron – nhân của đồng vị phóng xạ H2; hạt α – nhân của He (2He4) gồm 2 proton, 2 neutron, điện tích 2e+) và nhóm hạt trung bình (neutron) khơng mang điện, có thể xâm nhập vào mọi hạt nhân nguyên tử
b Bức xạ sóng điện từ
Là sóng điện từ phát ra trong khơng gian ở dạng dao động điện từ và từ trường, ví dụ như tia Rơnghen (tia X), tia γ Các sóng điện từ đặc trưng bằng bước sóng λ; C = λ γ (Trong đó, C – Tốc độ; γ – Tần số dao động; λ – Bước sóng)
2 3 1 2 Nhóm phóng xạ khơng gây ion hóa
Đại diện cho nhóm này là tia tử ngoại (λ = 10-7 – 10-5) Khi xuyên qua các mô sống của cơ thể sinh vật, nó khơng gây ion hóa mà chỉ gây kích động phân tử, sức xuyên thấu yếu nên thường dùng để xử lý hạt phấn và bào tử
2 3 2 Các dạng phóng xạ ứng dụng trong chọn giống
2 3 2 1 Tia X
Tia X là sóng điện từ có λ = 10-9m – 10-12m, được ứng dụng nhiều rất sớm và rộng rãi vào chọn giống vì: i- Thiết bị sản sinh ra tia X đơn giản, dễ sắm và thao tác không phức tạp; ii- Chiếu tia X trên hạt và các bộ phận khác của cây dễ dàng; iii- Tính liều lượng dễ; iv- Khi sử dụng khơng gặp phải những hạn chế như khi sử dụng neutron hoặc hóa chất (Lê Duy Thành, 2001)
2 3 2 2 Neutron
Việc sử dụng neutron chỉ bắt đầu khi xuất hiện những lò phản ứng nguyên tử Neutron nhanh trong các lị phản ứng hạt nhân có thể làm giảm tốc độ nhờ H2O2 (tương đương với tốc độ chuyển động nhiệt) gọi là neutron chậm Năng lượng của neutron cũng đo qua đơn vị R của tia X (năng lượng đơn vị này bằng năng lượng 1g nước hấp thụ khi chiếu 1R của tia X đi qua) Neutron ảnh hưởng đối với hạt tương đối đồng nhất, tỷ lệ sống sót ở M1 tương đối cao và tần số đột biến cao (Lê Duy Thành, 2001)
2 3 2 3 Các chất đồng vị phóng xạ
Những chất này tác động vào quá trình trao đổi chất của nhân tế bào và có khả năng gây đột biến, thường dùng P32 và S35 (có chu kỳ phân hủy ngắn nên ít nguy hiểm hơn các nguyên tố có chu kỳ phân giải dài) Tuy nhiên, chúng vẫn dễ gây nguy hiểm nên đến nay ít được dùng trong chọn giống
2 3 2 4 Tia γ
Trước đây, người ta thường dùng Rn và Ra làm nguồn cho tia γ, hiện nay thường dùng Co60 và Cs137 Tia γ có khả năng xun sâu cao, khơng kìm hãm quá trình sinh sản của cây, cho ra tỉ lệ đột biến có lợi cao Hiệu quả tác dụng của tia γ có thể thay đổi rất đáng kể dưới ảnh hưởng của các nhân tố bên ngồi như hàm lượng oxi, nhiệt độ và đặc tính sinh lý, sinh hóa của tế bào
2 3 3 Cơ chế gây đột biến của các tia phóng xạ
Cơ chế gây đột biến của tia phóng xạ có ba giả thuyết:
2 3 3 1 Thuyết bia
Các cơ quan tử hay nhiễm sắc thể (NST) trong tế bào được xem như là đơn vị cảm ứng (bia) Khi các lượng tử hay các hạt cơ bản va chạm vào các đơn vị cảm ứng sẽ gây ra biến đổi → đột biến Thuyết này giải thích chưa thỏa đáng vì
một số lồi có kích thước NST lớn nhưng lại có độ cảm ứng phóng xạ thấp hơn so với lồi có NST nhỏ
2 3 3 2 Thuyết các gốc tự do
Theo một số tác giả khơng chỉ có các cơ quan tử, các NST trong tế bào mới là bia mà phải kể tới các phân tử nước vì nước chiếm tỉ lệ cao trong tế bào Khi chiếu xạ vào cơ thể hay tế bào, nước hấp thu năng lượng dễ bị mất đi 1e- → ion (+): H2O → H2O+ + 1e- Điện tử giải phóng được phân tử nước khác hấp thu → ion (-): H2O + 1e-→ H2O- H2O+, H2O- khơng bền, phân hủy nhanh chóng tạo ra các gốc tự do H* và OH* cùng các ion bền vững H+ và OH- H2O+→ H+ + OH*; H2O-→ H*+ OH- Các gốc tự do H* và OH* phối hợp với oxi trong tế bào hoặc kết hợp với nhau tạo các phân tử peroxyd vô cơ: H*+ O2→ HO2*; HO2*+ H+→ H2O2; OH* + OH* → H2O2 Ngồi ra, các gốc tự do cịn kết hợp với các chất hữu cơ trong tế bào tạo nên peroxyd hữu cơ: RH + OH → R* + H2O; R*+ O2→ ROO* Các peroxyd tác động lên DNA theo nhiều phương thức: làm mất gốc NH2 của gốc dị vòng chứa nitơ; làm mất nguyên tử H2; làm đứt liên kết glycoside giữa đường và bazơ; oxi hóa đường pentose; đứt chuỗi nucleotide và tăng
phosphate vô cơ; tác động trực tiếp lên NST hay môi trường xung quanh NST gây ra đột biến về số lượng, cấu trúc NST
2 3 3 3 Thuyết hiện đại
Trong cơ thể tồn tại các hợp chất hữu cơ ở trạng thái lỏng có nồng độ khác nhau tùy thuộc vào trạng thái sinh lý của cơ thể Nếu nồng độ chất cao thì sự va chạm của lượng tử vào các phân tử nhiều hơn, hiệu quả tác động bia nhiều hơn Nếu nồng độ chất thấp thì các lượng tử của tia phóng xạ tác động lên phân tử nước theo thuyết tự do → thuyết hiện đại dung hòa hai thuyết trên Tần số đột biến phụ thuộc vào liều lượng phóng xạ, nhưng chỉ đến một mức độ nhất định thì liều lượng gần như khơng có tác dụng nữa Đặc biệt là hiệu quả tác dụng của tia tử ngoại phụ thuộc rất lớn vào độ dài của bước sóng, bước sóng trong khoảng 2500 – 2800Å có hiệu quả tác dụng lớn nhất
2 3 3 4 Cơ chế tác động tia gamma
Tia gamma thuộc nhóm bức xạ sóng điện từ, các tia phóng xạ thuộc nhóm này có độ dài bước sóng ngắn, mang năng lượng lớn, có thể xuyên sâu vào các mô sống nên được dùng để chiếu xạ hạt và các bộ phận khác của cây
Năng lượng gamma tùy thuộc vào tần xuất sóng và được biểu thị bằng cơng thức: E = h T Hay E =h c/λ Trong đó: T: Tần số sóng; λ: Bước sóng; h = 6,62 10-27erg/s (hằng số plăng) c: Tốc độ ánh sáng
Nguồn phóng xạ thường dùng để tạo bức xạ gamma là Coban 60 (Co60), liều phóng xạ được đo bằng đơn vị rơntghen (r) hoặc gray (1gray = 100 rơnghen) và được tính bằng số ngun tử ion hóa trên một đơn vị thể tích Trong thực tế, 1 rơntghen (r) được tính bằng lượng phóng xạ ion hóa tạo ra 2,038 x 10-9 cặp ion/1cm3 khí ở 0oC và áp suất 760 mmHg Đặc biệt, liều chiếu xạ có sự tích lũy theo thời gian, nghĩa là: chiếu xạ xuất liều thấp trong thời gian dài có thể tương đương với chiếu xạ xuất liều cao trong thời gian ngắn (xuất liều là liều chiếu xạ tính trên một đơn vị thời gian – thường là giây hoăc phút, do đó xuất liều chiếu xạ = liều chiếu xạ/ thời gian chiếu xạ) (Vũ Văn Liết & cs , 2013)
Như vậy, chiếu xạ tia gamma (Co60) vào vật mẫu ở liều xạ nhất định có thể chiếu với xuất liều lớn trong thời gian ngắn hoặc xuất liều nhỏ trong thời gian dài Mặc dù liều xạ tích lũy trong vật mẫu tương tự nhau nhưng trong một đơn vị thời gian lượng bức xạ tác động đến vật mẫu là khác nhau nên gây ra những tác động không giống nhau Tùy mục đích và yêu cầu của việc chiếu xạ mà chọn hình thức chiếu phù hợp
a Tác động ở cấp độ phân tử
Chiếu xạ bằng tia gamma (Co60) lên dung dịch ADN gây những biến đổi đa dạng trên cấu trúc của vật chất di truyền ở cấp độ phân tử như: đứt, gãy ADN, phá hủy cấu trúc khơng gian của ADN, phá hủy gốc nhị vịng chứa Nitơ, gây hiện tượng nhị trùng phân timin hay hidrat hóa các bazơ nitơ… Sau đó, các phân tử ADN này liên kết với nhau theo nhiều kiểu và tạo cấu trúc mới như: tạo cầu, phân tử phân nhánh, liên kết protein - ADN hoặc biến tính protein Tia gamma có thể gây hiện tượng hỗ biến, làm thay đổi vị trí của ngun tử hydro dẫn tới sự hình thành gốc lactin hay imin, gây ra sự sao chép sai của ADN, tạo ADN đột biến ở các thế hệ sau Tia gamma có thể làm tăng hiện tượng hỗ biến lên hàng