.Đặc điểm của vecto phage Lambda

- Có sự tham gia của một enzyme có khả năng cắt các dimer pyrimidin (làm đứt các liên kết đồng

4 .Đặc điểm của vecto phage Lambda

• Là 1 phage tiêu giải, nghĩa là sau khi xâm nhập tế bào chủ, phage sẽ nhân bản ADN của mình và tạo các virion, ly giải tế bào chủ rồi phóng thích phage.

• Vector:

 Khi được dung làm vecto người ta cắt bỏ một phần bộ gen của phage không liên quan đến quá trình tiêu giải và thay thế bằng đoạn ADN cần tạo dòng.

 Kích thước sau tái tổ hợp phải lớn hơn 78% (38 kb) và nhỏ hơn 102% (51 kb) so với dạng hoang dại (50 kb) thì mới đóng gói dễ dàng thành phage được.

 Phải chú ý đến kích thước đoạn gen muốn chèn, nếu đoạn gen mong muốn không đủ kích thước thì người ta sẽ nối thêm ADN độn khác để đủ kích thước có thể đóng gói được. • Ưu điểm trong xây dựng các thư viện tái tổ hợp.

 Đóng gói in vitro. Điều này rất có ý nghĩa vì khi đó chỉ cần một lượng ít vector và ADN cần chèn. Đóng gói in vitro là cách đơn giản nhất để đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào E. coli chủ.

 Các thư viện phage có thể dễ dàng phát hiện với mẫu dò, khuếch đại và bảo quản trong một thời gian dài.



Câu 5 : Kích thước tối đa của đoạn gene có thể tạo dòng bởi các vector khác nhau • Plasmid và phage lambda: <15 kb

• Cosmid: <45 kb

Câu 6 : Nguyên tắc hoạt động của vector cosmid

• Cắt vector bằng RE tại vị trí muốn tạo dòng và trộn với đoạn gene muốn (có chiều dài từ 35 - 45 kb),

• Vector và đoạn chèn sẽ được nối lại bằng ligase, tạo thành một sợi ADN thẳng với đoạn chèn bị kẹp giữa 2 phần của vector và tận cùng với các vị trí cos ở 2 đầu.

• Đóng gói in vitro nhờ nhận diện 2 vị trí cos: Sợi DNA này khi ủ với các protein vỏ sẽ tạo thành phage và được gây nhiễm vào E. coli.

• Sau khi vào tế bào chủ, ADN tái tổ hợp sẽ tạo thành vòng nhờ vị trí cos và hoạt động như một plasmid.

Đặc điểm của cosmid

• Cosmid là một dạng lai giữa phage và plasmid Mang yếu tố chọn lọc, điểm Ori của plasmid, • Vị trí tạo dòng : Các trình tự của phage lambda mã hóa cho vị trí cos.

• Uu điểm của cosmid :

 Tạo dòng các đoạn gen có kích thước lớn đến 50 kb.

 Có thể đóng gói in vitro và đưa gen vào tế bào bằng cách gây nhiễm, do đó đơn giản, hiệu quả và tiết kiệm ADN

 Trong tế bào hoạt động như plasmid: dễ thao tác, duy trì

Câu 7 : Cấu tạo chức năng và phân loại RE

Cấu tạo

Enzym cắt hạn chế (restriction enzym - RE) là các endonuclease có khả năng cắt ADN tại hay gần một trình tự nhận diện đặc hiệu.

Chức năng

Cắt và thoái hóa các ADN ngoại lai (ví dụ ADN phage) giúp cho bộ gen của vi khuẩn được ổn định.

Phân loại RE: có 3 loại

 Loại I và III mang một phức hệ gồm cả 2 hoạt tính cắt giới hạn và methyl hóa, loại này cần ATP để có năng lượng và nó cắt ADN tại vị trí khá xa điểm nhận diện. Hai loại này ít được dùng trong các thực hành sinh học phân tử.

 Loại II chỉ có hoạt tính endonuclease, không cần ATP để hoạt động và cắt ADN tại hoặc rất gần vị trí nhận diện. Loại II được sử dụng nhiều trong thực tiễn sinh học phân tử và hiện người ta đã biết khoảng 1000 .RE loại này và có vài trăm loại đã được thương mại hóa.

Câu 8 : Vị trí nhận diện cắt của RE

Vị trí nhận diện của đa số RE loại II thường chứa 4 - 6 nucleotid theo kiểu palindrome. Có 4 kiểu sắp xếp của trình tự nhận diện :

 Palindrome (ví dụ BamHI, EcoRI);

 Palindrome bị ngắt (HinfI, XmnI);

 Trình tự bị thoái biến, thường có phần còn lại của palindrome (EcoRII, HincII);

 Không phải palindrome (MboII).

RE chỉ cắt ADN sợi đôi và tạo ra 2 đầu tận 5’ phosphate và 3’ hydroxyl. Đầu cắt có thể tà (tù) hoặc so le (còn gọi là đầu dính) .

Nếu trình tự nhận diện có phần nào tính đối xứng thì điểm cắt thường nằm giữa nó và ở vị trí giống nhau cho mỗi sợi. Ngược lại thì vị trí cắt cách khoảng so với nó

Câu 9 : Đặc điểm của RE loại II và các kiểu cắt của nó

Đặc điểm

 Chỉ có hoạt tính endonuclease, không cần ATP để hoạt động và cắt ADN tại hoặc rất gần vị trí nhận diện

 Trình tự nhận diện cắt gồm 4-8 nucleotid,thường có kiểu palindrome, VD: GAATTC

Kiểu cắt

 Đầu tù: cắt hai mạch tại cùng một điểm

 Đầu tù: cắt hai mạch tại cùng một điểm

 Đầu so le/dính: cắt mỗi mạch tại một điểm khác nhau

Câu 10 : Các đặc tính của Polymerase

 Hoạt tính tổng hợp 5’- 3’: Hoạt tính kéo dài. Dùng dNTP để gắn thêm 1 deoxynucleotid-5’-

monophosphate vào đầu 3’ hydroxyl của mồi và phóng thích pyrophosphate. Tùy theo enzym, phản ứng cần có khuôn mẫu ADN, ARN, hay không.

 Hoạt tính exonuclease 3'- 5': chức năng “sửa lỗi”. Khả năng này đối với mạch đơn mạnh hơn.

Trên mạch kép nếu có đủ dNTP, hoạt tính tổng hợp mạnh hơn. Hoạt tính này cũng mạnh lên khi tăng nhiệt độ.

 Hoạt tính ribonuclease H: Chỉ có ở một số polymerase, nó phân hủy đặc hiệu ARN khi có sự

hiện diện của phức lai ARN/ADN.

 Dịch chuyển sợi : Một số polymerase có khả năng chuyển sợi cũ từ vai trò khuôn mẫu thành sợi

mới đang được tổng hợp.

 Khả năng xử lý : Là khả năng của 1 phân tử polymerase có thể tiếp tục tổng hợp trên sợi khuôn

trước khi tách ra và bị thay thế bởi một polymerase khác.

 Tần suất lỗi: Khi sử dụng in vitro tần suất này thường cao hơn in vivo và phụ thuộc vào điều kiện

tiến hành. Bên cạnh đó nó cũng tùy vào khả năng “sửa lỗi” và xử lý của polymerase.

Câu 11 : Phân loại Polymerase

Phân loại dựa trên sản phẩm và khuôn mẫu

 ADN polymerase phụ thuộc ADN: Enzym sao chép

 ARN polymerase phụ thuộc ADN: Enzym phiên mã

 DNA Polymerase phụ thuộc ARN: Reverse Transcriptase

 Polymerase không phụ thuộc khuôn mẫu: Primase

Câu 12 : Yếu tố quyết định tần suất lỗi của Polymerase

Enzym có hoạt tính sửa lỗi hay không:

 Hoạt tính exonuclease 3’- 5’ có chức năng “sửa lỗi”. Khả năng này đối với mạch đơn mạnh hơn. Trên mạch kép nếu có đủ dNTP, hoạt tính tổng hợp mạnh hơn. Hoạt tính này cũng mạnh lên khi tăng nhiệt độ.

 Tần suất lỗi: Khi sử dụng in vitro tần suất này thường cao hơn in vivo và phụ thuộc vào điều kiện tiến hành. Bên cạnh đó nó cũng tùy vào khả năng “sửa lỗi” và xử lý của polymerase.

Câu 13 Đặc điểm và ứng dụng của DNA polymerase I của E.coli và đoạn Klenow

Đặc điểm

 Là ADN polymerase phụ thuộc ADN

 Được phân lập từ E. coli, nhưng ngày nay đã được sản xuất từ chủng vi khuẩn có khả năng siêu tổng hợp enzym này.

Ứng dụng

 Chuyển khía (nick translation): ứng dụng trong đánh dấu acid nucleic

 Tổng hợp sợi thứ 2 của cADN

Đoạn Klenow

 Thu được nhờ tác động của enzym thủy phân protein trên polymerase I của E. coli .Đoạn Klenow không có hoạt tính exonuclease 5’-3’. Gần đây với công nghệ di truyền đã tạo được dòng sản xuất đoạn Klenow không có hoạt tính exonuclease (exo- Klenow enzym; Stratagene).

 Sử dụng

 Làm tà đầu 3’bị hụt (đầu dính)

 Loại bỏ đầu 3’ nhô ra.

 Đánh dấu đầu 3’ của ADN sợi đôi, đặc biệt đối với đầu 3’ bị hụt.

 Tổng hợp sợi thứ 2 của cADN, có ưu điểm hơn polymerase I vì không có hoạt tính exonuclease 5’- 3’.

 Đánh dấu bằng kỹ thuật mồi ngẫu nhiên.

 Giải trình tự ADN bằng phương pháp dideoxy.

 Tổng hợp ADN từ ADN sợi đơn với mồi đặc hiệu.

Câu 14 : Đặc điểm và ứng dụng của một số ligase

 Là enzym xúc tác phản ứng tạo liên kết phosphodiester giữa 3’-OH và 5’-P của hai sợi acid nucleic .

 ADN ligase hoạt động trên ADN sợi đôi. ARN ligase hoạt động trên ARN hoặc ADN sợi đơn ADN ligase của E. coli cần NAD để có năng lượng và có thể dùng sửa chữa chổ bị cắt khía hay nối các đầu dính

 ADN ligase của T4 cần ATP để hoạt động và có thể dùng để sửa chổ cắt khía, nối đầu dính và cả đầu tù

Câu 15 : Nội dung 3 bước của phương pháp tách chiết DNA

 Phá vỡ tế bào: vật lý, hóa học

 Phá vỡ tế bào vi sinh vật để phóng thich vật liệu di truyền có thể được thực hiện bằng phương pháp hóa học .

 Thường thì tách chiết DNA Vi khuẩn nguoi ta dung phương pháp hóa học . Phần ngoài tế bào vi khuẩn gồm thành tế bào và màng tế bào chất khi được xử lý với Lysozyme or EDTA sẽ bị yếu đi và dễ dàng bị phá vỡ

 Chiết tách acid nucleic: Phenol-Chloroform

 Để phân lập và cô đặc DNA Va ARN nguoi ta dung phenol – Chloroform sau đó tủa bằng ethanol .

 Để loai hoàn toan ARN người ta dung Ribonuclease .

 Phần tủa của xác tế bào và Protein được tach ra bằng ly tâm , pha nước bên trên sẽ chưa DNA và được rút ra

 Kết tủa acid nucleic: cồn tuyệt đối

Câu 16 : So sánh các phương pháp thu hồi DNA từ dịch chiết

Qui trình kết tủa kinh điển với etanol

 Đơn giản, rẻ, etanol dễ bay hơi, hòa tan trong muối tốt

 Tỷ lệ dịch ADN thấp (1:2,5)

 Cần cation 1+ Qui trình kết tủa khác

 Isopropanol tủa được nhiều dịch ADN hơn (1:0,7) không cần cation, bay hơi và hòa tan muối kém

 LiCl 8 M mà không có etanol: để tủa ARN lớn Thu hồi bằng hấp phụ

 Dễ thực hiện, tự động hóa, hiệu suất thu hồi và chất lượng tốt.

 Đắt tiền, không hiệu quả đối với acid nucleic nhỏ

Câu 17: Phương pháp tách chiết Plasmid

 Yêu cầu không lẫn ADN nhiễm sắc thể.

 Dựa trên một vài khác biệt về vật lý giữa ADN plasmid và ADN nhiễm sắc thể, mà chủ yếu là về kích thước và cấu dạng (conformation).

 Tách dựa trên kích thước

 Phá vỡ tế bào trong điều kiện được kiểm soát chặt chẻ và êm dịu .

 ADN nhiễm sắc thể không bị đứt đoạn nên có kích thước rất lớn và thường gắn với màng tế bào → loại bỏ bằng cách ly tâm.

 Tách dựa trên cấu dạng - Phương pháp thủy giải kiềm

 Tế bào bị phá vỡ với tác nhân tẩy ion hóa như SDS, khi đó các ADN lớn như nhiễm sắc thể bị đứt đoạn.

 pH dung dịch được nâng lên 12 - 12,5 bằng NaOH làm cho các ADN thẳng bị tách thành sợi đơn,

 ADN plasmid ở dạng supercoil (siêu xoắn) nên không bị tác động.

 Khi thêm acid để làm hạ pH, ADN sợi đơn lại tái hợp, nhưng vì sợi quá dài nên kết hợp không chính xác tạo nên bó rối dày đặc, không tan và có thể dễ dàng loại bỏ bằng ly tâm.

 Phương pháp này còn thuận lợi hơn vì trong điều kiện ly giải như vậy, hầu hết protein và ARN cũng trở thành không tan và bị loại bỏ.

Câu 18 : Các phương pháp tinh chế Acid Nucleic

• Ly tâm phân đoạn: dung dịch acid nucleic được siêu ly tâm trong thang tỷ trọng đường

saccarose hay CsCl2 khi đó các phân tử khác nhau sẽ tách theo tỷ trọng (tỷ lệ với kích thước phân tử). Cach này được áp dụng khi lượng acid nucleic cần tinh chế lớn.

• Điện di gel và sắc ký lọc gel: tách acid nucleic theo kích thước phân tử ở qui mô nhỏ (điện

di) hay lớn (lọc gel). Điện di với gel polyacrylamid (PAGE) có thể tinh chế các acid nucleic với khác b iệt 1 nucleotid.

• HPLC: được áp dụng chủ yếu đối với các oligonucleotid do độ phân giải lên đến 1

• Sắc ký hấp phụ: ARNm thường tận cùng bằng polyA, do đó được hấp phụ bằng resin

có gắn oligo dT hay dU.

Câu 19 : Nội dung lai phân tử . Các yêu tố ảnh hưởng đến lai phân tử

• Hai phân tử acid nucleic sợi đơn trong điều kiện thích hợp có thể bắt cặp bổ sung với nhau bằng các liên kết hydro để tạo thành phân tử sợi đôi, quá trình này gọi là lai hóa acid nucleic (hybridization).

• Phân tử sợi đôi thu được gọi là phân tử lai (hybrid) hay duplex.

• Quá trình ngược lại khi duplex tách ra thành các sợi đơn được gọi là sự biến tính (denaturation). • Phản ứng lai được xem là đặc hiệu khi sự bắt cặp bổ sung hoàn toàn của một phân tử với phân tử

còn lại diễn ra trên một vùng liên tục giữa hai mạch, ngược lại khi một phân tử chỉ bắt cặp một phần với phân tử kia thì sự lai hóa được xem là không đặc hiệu hay không hoàn toàn.

Các yếu tố ảnh hưởng

• Do bản chất của phản ứng lai là sự hình thành các lien kết hydro nên cân bằng phản ứng, độ đặc hiệu và độ bền của duplex phụ thuộc vào các yếu tố sau:

 Nhiệt độ: là yếu tố quyết định độ bền của liên kết hydro

 Độ dài các các trình tự lai: độ dài càng lớn duplex càng bền và thời gian phản ứng càng lâu.

 Tỷ lệ GC trong duplex: tỷ lệ GC càng cao duplex càng bền

 Nồng độ ion: ảnh hưởng đến độ bền của liên kết hydro

 Nồng độ các phân tử và thời gian phản ứng

• Nhiệt độ chảy (melting temperature, Tm): là nhiệt độ ở đó có 50% số duplex được hình thành. Nhiệt độ này phụ thuộc chiều dài và tỷ lệ GC của duplex, ngoài ra nồng độ ion cũng có ảnh hưởng lớn, do đó cách tính Tm khá phức tạp. Phản ứng lai sẽ diễn ra ở nhiệt độ nhỏ hơn Tm của duplex, ngược lại ở nhiệt độ lớn hơn Tm, sự biến tính của duplex sẽ chiếm ưu thế.

Câu 20 : Các kỹ thuật lai acid nucleic và ứng dụng :

Trong ứng dụng, phản ứng lai diễn ra giữa một phân tử đích (phân tử cần được phát hiện) và một đoạn dò (probe).

Đoạn dò là phân tử oligonucleotid được đánh dấu bằng phóng xạ,huỳnh quang, enzym hay các kỹ thuật đánh dấu khác

• Các kỹ thuật lai:

Lai trên màng rắn: Là phương pháp phát hiện acid nucleic trong kỹ thuật blot, trong đó màng

nitrocellulose thường được sử dụng. Các biến thể của lai trên màng:

 Southern blot

 Northern blot

 Dot blot

Lai tại chỗ : Là kỹ thuật lai dùng để định vị acid nucleic đích trong mô hay tế bào

Lai trong dung dịch: Phản ứng này được tiến hành giữa phân tử đích và đoạn dò tự do trong dung dịch ,

duplex sau đó tách ra khỏi dung dịch để phát hiện . • Ứng dụng :

• Trong sinh học phân tử, kỹ thuật lai được ứng dụng để phát hiện sự tồn tại của acid nucleic đích, nghiên cứu sự biểu hiện gen.

• Trong y học nó được ứng dụng trong chẩn đoán phát hiện bệnh dựa trên acid nucleic và nghiên cứu bệnh học.

Câu 21 : Phân biệt Southern Blot , Northern Blot va Dot Blot

• Southern blot: lai được thực hiện với ADN sau khi đã được điện di trong gel rồi được chuyển và cố định trên màng.

• Northern blot: lai được thực hiện với ARN sau khi đã được điện di trong gel rồi được chuyển và cố định trên màng.

• Dot blot: lai được thực hiện với hỗn hợp acid nucleic đích được chấm trực tiếp lên màng.

Đoạn dò là oligonucleotid được đánh dấu:

 phóng xạ,

 huỳnh quang,

 enzym

hay các kỹ thuật đánh dấu khác

Vai trò : Nhờ đó ta phát hiện được sự lai có diễn ra hay không hay nói cách khác phân tử đích có tồn tại

hay không .

Câu 23 : Nguyên Lý PCR

• Kỹ thuật PCR dựa trên đặc điểm của quá trình sao chép gene trong tế bào . • Khuôn ADN sợi đơn được gắn mồi nhờ lai hóa đặc hiệu .

• Trong điều kiện có sẵn nucleotid, ADN polymerase sẽ kéo dài mồi theo nguyên tắc bổ sung với