- Có sự tham gia của một enzyme có khả năng cắt các dimer pyrimidin (làm đứt các liên kết đồng
BÀI 8: KỸ THUẬT SINH HOC PHÂN TỬ
1 .Đăc điểm chủng JM109,DH 5 Alpha , DH 5Alpha F’, XL 1 blue ,
JM109
• Dùng để nhân bản các vector của phage M13 .
• Có thể dùng với plasmid pUC, là các plasmid sử dụng kỹ thuật bổ sung alpha để chọn lọc dòng tái tổ hợp.
• Chủng này bị mất gen β-galactosidase trên nhiễm sắc thể, nhưng có mang gen cho đoạn omega của β-galactosidase trên plasmid F’, cho phép nó bị nhiễm bởi các phage dạng sợi như M13. Nếu mất plasmid F’sẽ làm mất khả năng này, do đó phải duy trì chủng này trên môi trường tối thiểu.
• Có đột biến trên gen recA, làm cho nó mất khả năng tái tổ hợp tương đồng.
DH5-α
• Có đặc tính bổ sung alpha.
• Chủng này mang gen recA1 đột biến.
• Ngoài ra, nó còn mang đột biến deoR làm dễ dàng cho việc thu nhận các mảnh ADN lớn.
DH5-αF’
• Rất tốt cho việc nhân bản vector M13 mp.
• Cho phép tạo ra ADN sợi đơn từ plasmid có origin f1 (như vector M13) khi bị nhiễm đồng thời một phage trợ giúp (helper phage).
• Khác với JM103, F’ episome, cần để nhân bản phage sợi đơn, ổn định, không cần sử dụng môi trường tối thiểu để duy trì nó.
XL1-Blue
• Rất tốt để nhân bản các thư viện cADN hay genome
• Mang các đột biến làm bất hoạt hầu hết các RE của E.coli, do đó ngăn việc cắt các ADN có mang C hoặc A được metyl hóa
• Mang đột biến hsdR, ngăn sự cắt ADN đã tạo dòng bởi EcoK. • Mang recA, F’ và kỹ thuật bổ sung alpha.
• Mang gen kháng tetracyclin nên không dùng để chọn lọc dòng sau biến nạp.
Câu 2 : Vai trò của vector tạo dòng trong SHPT và yêu cầu của vecto tạo dòng
Vai trò
Vector tạo dòng là vật liệu di truyền trung gian để chuyển gen giữa các tế bào do chúng có khả năng được sao chép và phân phối vào các tế bào mới trong quá trình phân bào, nhờ đó gen đang nghiên cứu cũng được sao chép và hiện diện ở tất cả các tế bào xuất phát từ tế bào nhận gen ban đầu.
Yeu cau :
• Có thể được sao chép bởi tế bào nhận nó.
• Có trình tự nhận diện của enzym giới hạn để cắt và đưa gen ngoại lai vào.
• Mang một hay nhiều yếu tố chọn lọc nào đó để phân biệt hoặc chọn lọc tế bào nhận được vector với tế bào không nhận được.
Câu 3 : Đặc điểm và yêu cầu của vecto Plasmid
Plasmid là một phân tử ADN sợi đôi, dạng vòng kín, nhỏ có thể nhân bản độc lập với nhiễm sắc thể trong tế bào.
Yêu cầu:
• Có yếu tố đánh dấu để chọn lọc dòng tái tổ hợp, thường là một hay nhiều gen kháng kháng sinh. • Có điểm khởi đầu sao chép (Ori) cho phép nhân bản plasmid trong tế bào chất không phụ thuộc
NST.
• Các plasmid được sử dụng hiện nay thường có điểm Ori có thể kiểm soát được .Trình tự của Ori cũng quyết định số bản sao của plasmid trong một tế bào.
• Có vùng tạo dòng (Multiple Cloning Site - MCS): là một trình tự DNA ngắn, mang nhiều trình tự nhận diện duy nhất của các RE khác nhau nằm liên tiếp (polylinker), cho phép cắt để mở vòng plasmid và nối đoạn gen mong muốn vào.
• Ngoài ra, một số plasmid có thể mang yếu tố đánh dấu chèn để nhận biết plasmid sau khi đưa vào tế bào đã được nối với gen ngoại lai trong vùng tạo dòng hay chưa.
• Plasmid được đưa vào tế bào chủ bằng cách biến nạp (transformation) hay thẩm điện (electroporation)
Một số plasmid thông dụng
• pUC
• pBR322
• pGEM và pBluescript II