cho hiệu quả tập trung cao như các phương pháp khác. Đồng thời phương pháp thiết kế chế tạo đơn giản rẻ tiền khi không cần phải sử dụng màng lọc ion hoặc chế tạo kênh nano. Tuy nhiên việc tạo ra kênh nano bằng đứt gãy khi phóng điện đòi hỏi phải cung cấp vào kênh một điện áp cao khoảng điện áp từ vài trăm vơn đến vài nghìn vơn tùy loại vật liệu là kính hay đế silic. Thêm vào đó, khi cung cấp điện áp cao vào kênh cũng tạo ra nhiệt trong kênh và sơi kênh tạo bọt khí có thể gây hỏng kênh trong quá trình tập trung.
30
Để giải quyết vấn đề điện áp cao làm sôi kênh và hỏng kênh, một số nghiên cứu đã tiến hành giảm điện áp đánh thủng tạo kênh nano và điện áp hoạt động để tập trung protein. Nhóm nghiên cứu của giáo sư Chun-Pin Jen tại đại học quốc gia Chung Cheng, Đài Loan hiện đang hợp tác với nhóm nghiên cứu của chúng tơi tại đại học Cơng Nghệ, ĐHQG HN đã tiến hành nghiên cứu và cải tiến cấu trúc chip tập trung protein dựa trên phương pháp sử dụng điện áp DC đánh thủng tạo cấu trúc nano đứt gãy [12, 34].
Các nghiên cứu ban đầu được tiến hành có điện áp đánh thủng vài trăm vơn và giảm điện áp xuống 50 V ở các nghiên cứu hiện đang được tiến hành. Các hạt nano vàng được sử dụng để chèn vào giữa lớp vật liệu PDMS và kính ở vị trí khe giữa các kênh giúp giảm điện áp đánh thủng để tạo ra các kênh nano nối với hai kênh micro. Cấu trúc chip vi kênh sử dụng hạt nano vàng để tạo ra kênh nano cũng được cải tiến thay vì gắn hạt nano vàng lên khe PDMS thì nano vàng được gắn lên phiến kính. Ở thiết kế cải tiến này, hạt nano vàng đường kính 13 nm trước tiên được gắn lên một vùng định sẵn trên tấm kính nền. Sau đó kênh vi lỏng PDMS được gắn lên trên tấm kính nền và hệ quả là hạt nano vàng được chèn vào giữa lớp PDMS và tấm kính [11].
Hình 1.13 mơ tả thiết kế chế tạo chip tập trung protein dựa trên việc sử dụng
các hạt nano vàng. Chip tập trung được cấu trúc bởi 3 vi kênh có độ rộng 100 µm và độ cao 2 µm. Kênh chính ở giữa cách hai kênh phụ hai bên bởi một khe 40 µm. Kênh được chế tạo bằng vật liệu PDMS gắn xuống đế là một tấm kính nền. Các hạt nano vàng được phủ lên vùng PDMS ở khe giữa hai kênh và bị kẹp giữa lớp PDMS và lớp kính sau khi tiến hành gắn kênh lên trên đế kính. Sau khi chip được chế tạo, các kênh phụ được bơm dung dịch PBS vào kênh. Kênh chính được bơm dung dịch đêm PBS vào một đầu kênh và mẫu protein BSA vào đầu kênh cịn lại. Sau đó, điện áp DC được cấp vào vào kênh để tạo ra các đứt gãy nano tại vùng gắn các hạt nano vàng. Tiếp đó q trình tập trung protein được thực hiện bằng cách cung cấp các điện thế chênh lệch ở hai đầu kênh chính
31
Hình 1.13. Mô tả cấu trúc chip tập trung protein bằng phương pháp đánh thủng điện áp: (a)Thiết kế; (b) chế tạo; (c) hình thực tế của chip tập trung protein bằng cách sử dụng hạt nano vàng chèn vào giữa lớp PDMS và kính nền [12].
Với cấu trúc chip này, mẫu 2µl của 10 nM protein BSA có thể được tập trung lại ở một vùng diện tích nhỏ, nồng độ tăng lên 104 lần sau tập trung với thời gian tập trung 30 phút.
Với sự phát triển mạnh mẽ của chip vi kênh ứng dụng trong xét nghiệm sinh học những thập kỷ gần đây, các chip vi kênh đã được tạo ra với mục đích tập trung protein trong một vùng nhỏ giúp tăng khả năng phát hiện protein có nồng độ thấp đáp ứng với một lượng lấy mẫu rất nhỏ cỡ nano-lít đến micro-lít và đẩy nhanh q trình phát hiện. Bằng cách sử dung phương pháp điện như dòng chảy điện di, điện thẩm trên nền cấu trúc kênh nano mét hoặc micro mét, các chip có thể được chế tạo và hoạt động với hiệu suất tập trung cao với hệ số tập trung từ 104 đến 106. Các kênh nano đã được tạo ra bằng các phương pháp khác nhau trong kênh vi lỏng để hình thành các vùng nghèo ion ở trong kênh. Điều này giúp tạo ra các bẫy giúp tập trung protein lại
32
ở một vùng thể tích nhỏ. Các chip tập trung protein nêu trên hầu hết sử dụng phương pháp đo cường độ huỳnh quang để phát hiện và định lượng protein bằng cách gắn sử dụng chất phát huỳnh quang lên kháng thể đã bắt dính với protein.
Cảm biến sinh học kiểu trở kháng và tụ điện sử dụng các phương pháp đo điện trong xét nghiệm sinh học và xét nghiệm protein
Cảm biến sinh học trên nền các chip sinh học đã được nghiên cứu và phát triển mạnh thời gian gần đây. Cảm biến sinh học đa phần được phát triển dựa trên xét nghiệm miễn dịch sử dụng kháng thể sinh học, DNA, Aptamer để bắt dính đặc hiệu các hạt sinh học cần được xét nghiệm như tế bào ung thư, vi rút, vi khuẩn hay protein. Cảm biến sinh học thường có cấu trúc vài chục đến vài nghìn micro-mét. Các kháng thể có thể được gắn cố định trên đế vàng và sử dụng các phương pháp vật lý để phát hiện kháng nguyên bị bắt dính như phương pháp quang học hay nhuộm màu huỳnh quang [35, 47, 74]. Bên cạnh phương pháp quang học, phương pháp đo điện cũng đang được nghiên cứu và phát triển mạnh trên nền các cấu trúc vi chip ứng dụng cho xét nghiệm sinh học. Có thể chia phương pháp điện thành hai loại là phương pháp đo dùng dòng điện một chiều (DC) và phương pháp đo dùng dòng xoay chiều (AC) để đo các đại lượng thay đổi như dòng điện, điện thế, điện trở, điện dung thay đổi của cảm biến sinh học. Phương pháp đo dịng một chiều thường được sử dụng tích hợp trên các cấu trúc transitor trường để phát hiện sự có mặt của các hạt sinh học trên vùng bắt giữ sử dụng kháng thể [78], [5]. Những thiết kế này sử dụng hiệu ứng trên transitor trường để phát hiện sự thay đổi của dòng điện tương ứng với sự xuất hiện của các lớp phân tử hóa học sinh học khi chúng được gắn lên vùng phát hiện. Một hướng nghiên cứu khác sử dụng phương pháp đo đặc trưng trở kháng bằng dòng thế tương ứng (CV) trong điện hóa để áp dụng trong cảm biến sinh học [14]. Trong nghiên cứu này, một kít mạch đo (LMP91000 evaluation board) điện hóa đã được sử dụng để đo đặc trưng dòng thế của cảm biến sinh học. Cảm biến này được phát triển để đo nồng độ cortisol ứng dụng trong xét nghiệm cortisol và bằng cách sử dụng kháng thể gắn trên cảm biến, cảm biến có thể phát hiện được cortisol cỡ pM. Bên cạnh đó, phương pháp đo trở kháng cũng có thể được áp dụng trong các thiết kế chip
33
có cấu trúc kênh vi lỏng với nhiều ưu điểm. Trong kênh vi lỏng, việc chế tạo các điện cực được thực hiện dễ dàng với nhiều kiểu cấu trúc hình dạng khác nhau. Các kháng thể có thể được gắn trên điện cực như điện cực vàng bằng cách hoạt hóa bề mặt từ đó protein có thể bắt giữ trên đế vàng thơng qua kháng thể gắn trên đó [34]. Phát hiện protein trong kênh vi lỏng dựa trên xét nghiệm miễn dịch và đo trở khảng đã được thực hiện khi các kháng nguyên được cấy lên điện cực dùng để bắt dính protein [20]. Nghiên cứu sử dụng nano vàng gắn xuống điện cực giúp thay đổi độ dẫn của cảm biến khi protein bị bắt dính trên các điện cực cũng được thưc hiện [40]. Ở nghiên cứu này, để tạo độ dẫn cho cảm biến thì ngồi hạt nano vàng, các nhà nghiên cứu còn phải cấy thêm hạt vàng cỡ micro.
Các nghiên cứu sử dụng phương pháp đo điện hóa đã được phát triển trong cảm biến sinh học cũng như phát hiện protein [16],[20]. Phương pháp đo trở kháng đã được phát triển đặc biệt là phương pháp đo phổ trở kháng được dùng để khảo sát đặc tính điện của cảm biến trong một dải tần số rộng [1, 4, 16, 26, 30, 37, 60, 62, 66, 82]. Phương pháp đo phổ trở kháng trên cảm biến điện hóa 3 điện cực yêu cầu phải tích hợp hệ tham chiếu hay điện cực tham chiếu để có thể hoạt động được. Việc tích hợp cảm biến điện hóa vào trong kênh vi lỏng gặp nhiều khó khăn hơn trong việc chế tạo chip có tích hợp nhiều chức năng khi phải tiến hành nhiều bước chế tạo khác nhau trên cùng một chip.
Bên cạnh cảm biến điện hóa, cảm biến tụ phẳng hai điện cực hoạt động dựa trên phương pháp đo trở kháng và đo điện dung của cảm biến cũng được nghiên cứu và phát triển để áp dụng trong các cảm biến sinh học [6, 18, 46, 54, 57]. Các loại cảm biến dựa trên nền tảng cấu trúc tụ phẳng có nhiều hình dạng khác nhau đã được nghiên cứu và phát triển. Phương pháp đo tụ dựa trên nguyên lý thay đổi điện môi của môi trường giữa hai bản tụ bao gồm điện môi ở bề mặt lớp tiếp xúc giữa điện cực và dung dịch với điện mơi của mơi trường của dung dịch có thể được khai thác để phát hiện sự thay đổi trên các lớp bề mặt điện cực [6, 27, 70, 71, 83, 41, 43, 48, 50, 55, 56, 63, 68]. Các cấu trúc cảm biến thường thấy là cấu trúc tụ phẳng hình trịn, chữ nhật và
34
răng lược. Cấu trúc kiểu răng lược cũng được các nghiên cứu tối ưu để tích hợp trong các cảm biến sinh học và kênh vi lỏng [9, 15, 79, 81, 23, 27, 29, 31, 32, 58, 65, 67]. Cấu trúc cảm biến tụ phẳng kích thước micro có nhiều ưu điểm như dễ dàng chế tạo với nhiều hình dạng khác nhau, thuận lợi trong việc tích hợp trong chip vi kênh và thuận tiện cho việc tích hợp xử lý tín hiệu cũng như giá thành rẻ đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu. Phương pháp xét nghiệm miễn dịch cũng được thực hiện trên cấu trúc này bằng cách gắn các kháng thể trên các điện cực của cảm biến tụ phẳng để tạo thành các cảm biến miễn dịch kiểu tụ điện. Các phép đo phân tích trở kháng và tụ bề mặt có thể được áp dụng trong phát hiện mẫu kháng nguyên như protein bị bẫy trên kháng thể cấy lên trên điện cực. Các cấu trúc cảm biến miễn dịch kiểu tụ điện đang là một ứng viên tiềm năng áp dụng cho các bài toán xét nghiệm nhằm phát hiện các kháng nguyên sinh học.
Kết luận chương
Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ vi cơ ứng dụng trong sinh học, các chip sinh học ra đời đã và đang được nghiên cứu cũng như ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của sinh học cũng như y tế. Xét nghiệm protein là một xét nghiệm quan trọng trong chẩn đốn bệnh, được nhiều nhóm nghiên cứu trong lĩnh vực vi cơ và vi cảm biến quan tâm nghiên cứu và phát triển. Các chip phát hiện protein với kích thước nhỏ cỡ minimét hoặc micromét được phát triển sử dụng các hiệu ứng vật lý kết hợp với phương pháp xét nghiệm miễn dịch nhằm phát hiện protein đặc hiêu cụ thể. Đặc biệt, các chip phát hiện protein sử dụng kênh vi lỏng với nhiều ưu điểm vượt trội như khả năng tự động hóa cao, lượng lấy mẫu nhỏ cũng đã được phát triển. Bên cạnh đó, nhằm đẩy nhanh q trình xét nghiệm và tăng khả năng phát hiện protein, các chip tập trung protein trên nền kênh vi lỏng cũng đã được nghiên cứu và phát triển. Các chip này đã chứng tỏ được khả năng tập trung protein với hiệu suất cao. Tuy nhiên các chip này đa phần phải sử dụng phương pháp đo huỳnh quang để phát hiện protein và chưa được tích hợp cảm biến trong kênh vi lỏng. Thêm vào đó, mặc dù đã sử dụng kháng thể gắn chất phát quang nhưng chip chưa có tính năng bắt giữ chọn lọc. Đây
35
là một tính năng quan trọng để phát hiện xem trong mẫu xét nghiệm có kháng ngun hay khơng. Thơng thường để chọn lọc loại protein thì kháng thể phải được cố định tại một vùng. Sau khi kháng thể và kháng nguyên bắt cặp với nhau thì chức năng chọn lọc được thực hiện bằng cách rửa kênh nhằm loại bỏ những đối tượng sinh học không phải là kháng nguyên. Điều này làm tăng độ tin cậy trong việc phát hiện protein do sự xuất hiện các hạt sinh học không phải là protein sẽ dẫn đến làm kết quả đo bị sai lệch. Sau khi kênh được tiến hành rửa thì chỉ còn lại protein bị bắt giữ bởi kháng thể ở lại trong kênh. Sau quá trình chọn lọc, bộ phát hiện được sử dụng để phát hiện sự có mặt của protein cụ thể bị bắt giữ đặc hiệu bởi kháng thể.
Các nghiên cứu trong nước liên quan đến thiết kế chế tạo và thử nghiệm chip sinh học cũng đã phát triển mạnh mẽ, tuy nhiên mới chủ yếu tập trung vào việc ứng dụng công nghệ micro-nano kết hợp với xét nghiệm miễn dịch để tạo ra các vi chip sinh học. Hướng nghiên cứu tích hợp xây dựng thành một hệ vi chip đa chức năng trên nền kênh vi lỏng với nhiều ưu điểm nổi trội vẫn cần được tiến hành nghiên cứu hướng tới các ứng dụng xét nghiệm trong y sinh. Phát triển các chip vi lỏng trong xét nghiệm protein mặc dù đã được một số nhóm nghiên cứu trong nước và nước ngồi thực hiện, tuy nhiên, việc tạo ra một hệ thống chip tích hợp đầy đủ các tính năng tập trung, bắt giữ chọn lọc và phát hiện protein trên nền tảng vi lưu vẫn chưa đạt được nhiều kết quả. Đây là một hướng nghiên cứu triển vọng để nghiên cứu sinh thực hiện trong luận án này. Việc nghiên cứu và phát triển chip protein trên nền kênh vi lỏng có đầy đủ các tính năng nêu trên là bước đầu trong việc tạo ra một thiết bị nhỏ gọn có khả năng ứng dụng trong phát hiện nhanh protein đặc hiệu trong mẫu bệnh phẩm với tính tự động hóa cao và dễ dàng vận hành. Thêm vào đó, việc chip vi lỏng có thể thay thế các thiết bị cồng kềnh đắt tiền cũng là một lý do để các nghiên cứu tiếp theo về lĩnh vực này được tiến hành.
36
Chương 2. NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VÀ CHẾ TẠO HỆ THỐNG PHÁT HIỆN PROTEIN DỰA TRÊN HỆ THỐNG VI LƯU THAO TÁC TẬP TRUNG TÍCH HỢP CẢM BIẾN MIỄN DỊCH KIỂU TỤ PHẲNG
Như đã trình bày ở Chương 1, các chip vi kênh đã được nghiên cứu và phát triển mạnh với mục đích tập trung làm giàu protein với thể tích ban đầu vào một vùng thể tích nhỏ hơn rất nhiều lần. Các nguyên lý khác nhau đã được sử dụng tạo ra một chip có nhiều ưu điểm nổi trội về khả năng phát hiện, lượng lấy mẫu nhỏ và giảm thời gian xét nghiệm. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu chỉ mới tập trung phát triển chip có tính năng tập trung protein mà chưa được tích hợp tính năng bắt giữ chọn lọc và phát hiện protein trong chip. Ở các chip được phát triển ở các nghiên cứu trước đây, việc phát hiện protein tập trung tại một vùng nhỏ trong kênh vi lỏng được tiến hành bằng cách sử dụng một hệ quang học tích hợp camera và đèn phát kích thích huỳnh quang cồng kềnh và đắt tiền. Thiết bị này cũng địi hỏi tốn thời gian trong q trình vận hành cụ thể là việc khởi động đèn kích thích cần một thời gian để ổn định đèn và cường độ huỳnh quang phải được chuẩn hóa. Nội dung Chương 2 của luận án trình bày quá trình tiến hành nghiên cứu chế tạo một chip sinh học với chức năng tập trung, bắt giữ chọn lọc và phát hiện protein dựa trên nền tảng cấu trúc kênh vi lỏng. Bên cạnh đó với định hướng phát triển thành một thiết bị xét nghiệm nhỏ gọn, một mạch đo phân tích phổ trở kháng đặc thù áp dụng cho cấu trúc chip này cũng được tiến hành nghiên cứu và chế tạo.
Hệ thống phát hiện protein với các chức năng tập trung, chọn lọc và phát hiện
Để chế tạo chip protein với các chức năng tập trung, chọn lọc và phát hiện protein, các phương pháp đã được tiến hành nghiên cứu. Hình 2.1 mơ tả các phương pháp đã được áp dụng để chế tạo ra một chip protein đáp ứng các yêu cầu đã đặt ra