TỤ PHẲNG
Cảm biến miễn dịch tụ phẳng điện cực tròn
đến 90 kHz với các tỉ lệ tín hiệu trên tạp khác nhau; (b) sai số của bộ khuếch đại ứng với các tỉ lệ tín hiệu trên tạp.
57
Sai số ở các dải tần khác nhau không chênh lệch nhiều ở một tỉ lệ tín hiệu trên tạp nhất định và sai số tăng lên khi tỉ lệ tín hiệu trên tạp giảm đi. Cụ thể, ở tỉ lệ tín hiệu trên tạp (SNR) lớn hơn 0.005 thì sai số đo dưới 1% trong toàn dải tần số từ 10 kHz đến 90 kHz. Khi SNR tính theo cơng suất giảm đi thì sai số bắt đầu tăng mạnh. Ở 0.0025 SNR sai số lớn hơn 3% và ở 0.00176 là xấp xỉ 9% (Hình 2.9(b)). Tiếp theo, thực nghiệm tiến hành khảo sát đo phổ trở kháng của một mạch RC được mắc nối tiếp để tìm ra thành phần tụ và trở ở dải tần số từ 10 kHz đến200 kHz.
Hình 2.10. Kết quả sử dụng module đo phổ trở kháng để đo giá trị tụ 104 pF và trở 47 kΩ được mắc nối tiếp của mạch RC ở dải tần từ 10 kHz đến 200 kHz: (a) kết quả đo tổng trở; (b) góc pha thay đổi; (c) giá trị điện trở R đo được trong mạch mắc nối tiếp; (d) giá trị tụ điện đo được trong mạch mắc nối tiếp.
Hình 2.10 mơ tả kết quả đo phổ trở kháng của mạch nối tiếp RC với giá trị trở
58
số từ 10 kHz đến 200 kHz với bước nhảy tần số 10 kHz. Hình 2.10(a) và (b) mơ tả giá trị của tổng trở và góc pha thay đổi tương ứng với sự tăng lên của tần số. Tần số càng tăng thì góc pha và trở kháng càng giảm. Từ tổng trở và góc pha có thể tính ra được các giá trị điện trở R và tụ điện C. Hình 2.10(c) và (d) là các kết quả đo R và C tại các tần số khác nhau trong dải từ 10 kHz đến 200 kHz. Kết quả khảo sát cho thấy các giá trị của tụ và trở được đo chính xác với sai số dưới 2% ở dải tần nhỏ hơn 150 kHz. Ở dải tần lớn hơn 150 kHz thì sai số đo tăng lên có thể do một số nguyên nhân như ảnh hưởng của tụ ký sinh lên mạch đo và đáp ứng mạch đo ở tần số cao giảm. Trong mạch RC nối tiếp, thành phần dung kháng thay đổi theo tần số (Zc=-j/ωC) dẫn đến góc pha thay đổi theo tần số. Giá trị tụ và trở được tính ra thơng qua góc pha và các thành phần trở kháng. Do vậy việc đo chính xác các giá trị tụ và trở trong một mạch mắc nối tiếp đòi hỏi các giá trị đo ban đầu về góc pha phải chính xác. Với kết quả đo tụ và trở chính xác với sai số nhỏ đã gián tiếp chứng minh khả năng phân tích pha chính xác của bộ khuếch đại Lock-in.
Kết quả khảo sát cho thấy mạch đo hoạt động với khả năng kháng nhiễu tốt. Bằng việc áp dụng khuếch đại Lock-in vào việc đo trở kháng, các thành phần tổng trở, góc pha, phần thực và phần ảo có thể được xác định nhằm áp dụng trong bài toán đo cảm biến sinh học.
Chế tạo chip vi kênh tập trung và phát hiện protein
Quy trình chế tạo một chip tập trung và phát hiện protein bao gồm nhiều bước bao gồm: chế tạo vi kênh PDMS, chế tạo điện cực của cảm biến tụ phẳng trên phiến kính, gắn hạt nano vàng trên phiến kính có điện cực vàng đã được chế tạo, gắn kênh vi lỏng PDMS lên chip và gắn kháng thể lên điện cực vàng trong vi kênh. Sau đó mạch điện đo phổ trở kháng đã được thiết kế, chế tạo và áp dụng để đo đặc trưng điện của cảm biến tụ phẳng hai điện cực.
Chế tạo kênh vi lỏng
Kênh vi lỏng được chế tạo bằng vật liệu Polydimethylsiloxan (PDMS) là một loại vật liệu silicon. Vật liệu PDMS có đặc tính trong suốt, trơ, mềm dẻo vì thế là một
59
vật liệu phổ biến trong phát triển các chip kênh vi lỏng. Để chế tạo kênh vi lỏng, PDMS được tạo ra dưới dạng lỏng và sau đó được đổ vào khn để tạo hình dạng kênh. Để tạo ra hỗn hợp PDMS dạng lỏng, hỗn hợp chất đàn hồi silicon Dow Corning Sylgard 184 (phần A) và chất đóng rắn đàn hồi silicon (phần B) được trộn theo tỷ lệ 10: 1 (trọng lượng / trọng lượng). Sau đó, hỗn hợp được để đổ vào một khuôn tạo kênh. Sau khi PDMS dạng lỏng được đổ vào khn, các bọt khí sẽ xuất hiện trong q trình trộn. Để khử bọt khí trong PDMS lỏng, một buồng hút chân không được sử dụng. Cả mẫu có chứa khn và dung dịch dạng lỏng được đặt vào trong buồng chân không. Hỗn hợp PDMS được giữ trong 45 phút ở trong buồng để hút bỏ bọt khí bằng một bơm chân khơng. Sau đó, mẫu có khn và PDMS được lấy ra và đặt trong lò để ở nhiệt độ 80 °C trong vòng 2 giờ. Khn sau đó được lấy ra khỏi lị và kênh PDMS được bóc ra khỏi khn. Các kênh PDMS có thể được sử dụng ngay hoặc được bảo dưỡng có thể được giữ trong thời gian dài hơn ở nhiệt độ phòng trước khi được mang ra sử dụng.
Hình 2.11. Quy trình chế tạo kênh vi lỏng.
Để chế tạo khuôn, chất cảm quang SU8 (một loại chất cảm quang âm - Negative Photoresist) được tiến hành phủ lên kính hoặc phiến silic để tạo một lớp có độ dày phụ thuộc vào tốc độ và thời gian quay phủ. Hình 2.11 mơ tả q trình tạo khuôn của
60
kênh trên tấm silic. Trong bước đầu tiên, dung dịch chất SU8-2002 được nhỏ lên trên phiến silic. Sau đó, tiến hành quay phiến silic ở tốc độ quay 3000 vòng/phút với thời gian 2 phút. Bước tiếp theo, việc tạo hình dạng khn được thực hiện bằng phương pháp quang khắc sử dụng nguồn sáng UV và mặt nạ. Mặt nạ được sử dụng bằng cách đặt lên trên phiến silic đã phủ lớp SU8 để hở phần tạo hình. Tiếp tục, phiến silic được đặt vào máy sử dụng nguồn UV công suất cao để tạo kết phần phơi ánh sang chiếu vào. Sau đó, phiến silic được lấy ra và ngâm vào dung dịch (Developer) để ăn mòn lớp SU8. Sau khi đã tạo hình được lớp SU8 tạo kết, phiến silic được rửa thì nó đã thành một khn có thể được sử dụng để tạo kênh với cấu trúc là lớp SU8 được tạo kết trên phiến silic. Khuôn này được sử dụng để tạo kênh và có thể dùng lại nhiều lần. PDMS sau khi được pha ở dạng lỏng được đổ vào khuôn. Sau một thời gian PDMS đóng rắn, kênh vi lỏng được hình thành và tấm PDMS chứa kênh được lấy ra.
Chế tạo điện cực trên kính, gắn nano vàng trên phiến kính
Hình 2.12 mơ tả quy trình gắn điện cực vàng lên đế và gắn kênh PDMS lên
phiến kính, gắn nano vàng lên vùng đánh dấu và tạo chip vi kênh bằng cách gắn kênh PDMS lên đế chip để tạo chip. Một chip vi lỏng thông thường được cấu tạo bởi các vi kênh được chế tạo trên nền PDMS và tấm nền có thể là phiến silicon hoặc phiến kính có gắn các điện cực vàng trên đó. Để chế tạo các cấu trúc điện cực trên kính, phiến kính được phủ một lớp crom rồi phủ thêm lớp vàng lên trên lớp crom trước khi được tạo hình điện cực. Sau đó, để tạo hình cho điện cực người ta sử dụng phương pháp quang khắc.
Phiến kính đã được chế tạo có phủ sẵn một lớp crom và một lớp vàng trên đó được quay phủ tiếp một lớp cảm quang S1813 lên bề mặt. Lớp cảm quang này bị thay đổi cấu trúc khi tia UV chiếu vào. Sau khi phủ lớp cảm quang lên trên bề mặt, phiến kính được đưa vào máy chiếu tia UV và được đặt một mặt nạ lên trên. Tiếp đó, tia UV được chiếu vào giúp tạo hình các vùng điện cực. Lúc này việc tạo hình cho điện cực được thực hiện khi phần bị che bởi mặt nạ giữ lại lớp cảm quang. Sau khi phơi sáng bằng tia UV, lớp cảm quang đã có hình dạng của điện cực mong muốn. Dung
61
dịch tạo hình (Developer) được sử dụng để loại bỏ phần đã được tia UV chiếu vào. Tiếp đó, phiến thủy tinh được được vào dung dịch hóa chất để ăn mịn lớp kim loại vàng và Crom không được phủ lớp cảm quang. Sau vài phút dùng hóa chất ăn mịn, chip được rửa đi cịn lại hình dạng của điện cực được phủ bởi lớp cảm quang. Bước cuối cùng là ngâm phiến kính vào axeton để loại bỏ lớp cảm quang và phiến kính được rửa đi bằng cồn và nước DI và cuối cùng được sấy khô. Trước khi các hạt nano vàng được gắn trên phiến kính, lớp cảm quang được phủ lên để tạo vùng nơi hạt vàng sau khi gắn được giữ lại. Do hạt vàng không gắn trên tồn bộ phiến kính mà chỉ gắn ở vùng là khe giữa hai kênh vi lỏng. Sau khi phủ lớp cảm quang trên bề mặt thì phương pháp khắc quang học được sử dụng để tạo hình và định vị vùng gắn hạt vàng.
Hình 2.12 mơ tả quy trình gắn hạt vàng lên phiến kính. Dung dịch 6 µl of 0.1% v/v
(3-aminopropyl) triethoxysilane/H2O được nhỏ lên vùng gắn và để trong vịng 1 phút để phủ lớp hoạt hóa bề mặt trước khi gắn hạt vàng. Sau đó, 30 µl dung dịch chứa hạt nano vàng (AuNPs) được nhỏ lên và để phản ứng trong một tiếng. Sau khi gắn xong, một tấm mặt nạ được gắn xuống mặt dưới tấm kính để đánh dấu vùng gắn hạt nano vàng. Khi các hạt nano vàng đã hồn tồn lên kính, lớp cảm quang được loại bỏ chỉ để giữ lại nano vàng trên vùng khơng có lớp cảm quang. Sau bước gắn hạt nano vàng, chip đã sẵn sàng bước tiếp theo là gắn kênh PDMS lên phiến kính.
Gắn kênh vi lỏng lên chip
Để gắn phiến kính lên kênh PDMS thì các bề mặt của phiến kính được làm sạch, sau đó bề mặt của kênh PDMS cùng với phiến kính đã gắn hạt nano vàng và điện cực được đưa vào máy oxy plasma trong vòng một phút. Sau khi xử lý xong bề mặt bằng máy oxy plasma, kênh và phiến kính được đưa ra và đặt lên kính hiển vi để soi gắn. Để đảm bảo tạo ra cấu trúc nano đứt gãy khi sử dụng điện áp đánh thủng vùng tiếp giáp, vi kênh phải gắn được tốt với chip. Do vậy bước gắn chip với kênh là một bước quan trọng trong q trình chế tạo. Điều này địi hỏi q trình gắn phải diễn ra trong thời gian ngắn sau khi chip và vi kênh PDMS được lấy ra từ máy oxy plasma.
62
Hình 2.12. Quy trình chế tạo chip bao gồm tạo điện cực, gắn hạt nano vàng và gắn vi kênh lên chip.
63
Hình 2.13(a) mơ tả phần việc gắn kênh phải đảm bảo kênh chữ thập được gắn đúng
vị trí của cảm biến cũng như vị trí của lớp nano vàng phải ở vị trí khe giữa hai kênh. Việc gắn đúng vị trí địi hỏi cần một khoảng thời gian điều chỉnh vị trí tương đối giữa kênh và chip.
Hình 2.13. Thiết kế hệ gắn vi kênh lên chip có vùng nano vàng và điện cực; (a) hình mơ tả hai phần chip và vi kênh cùng với mô tả thiết bị gắn bao gồm phần dịch chuyển và phần gắn lên vi kênh; (b) hình ảnh thực tế của hệ thống gắn kênh lên chip.
64
Để giảm thời gian gắn, một công cụ hỗ trợ đã được thiết kế để phục vụ quá trình gắn. Nguyên lý của bộ gắn sử dụng một bộ dịch chuyển bốn chiều có tinh chỉnh theo hướng x,y,z và xoay theo trục z (Hình 2.13(a)). Phần kênh được cố định vào một khung trên một tấm kính nền để tiện cho việc lấy ra và cố định vào bộ gắn sau khi q trình plasma bề mặt được hồn thành. Phần chip và kênh cũng được ướm thử trước khi được làm sạch bề mặt và cho vào máy oxy plasma. Hình 2.13(b) mơ tả hệ thực tế được chế tạo dùng để gắn kênh. Hai phần khung chính cố định và khung phụ được gắn kênh để mang vào được máy oxy plasma. Sau khi chip và vi kênh được xử lý bề mặt bằng plasma, chúng được đem ra và đặt vào hệ gắn để gắn hai phần lại bằng cách điều chỉnh các trục. Trong hệ này, một bộ vi dịch chuyển 4 chiều đã được sử dụng nhằm đặt chính xác vị trí của kênh lên điện cực và vùng đánh dấu hạt nano vàng.
Quy trình gắn kháng thể
Bước gắn kháng thể là bước cuối cùng trong việc chế tạo chip. Quá trình gắn được thực hiện bằng cách ủ và rửa các chất sinh hóa lên trên bề mặt điện cực ở bên trong kênh vi lỏng có chiều cao 2 µm. Q trình gắn kháng thể được thực hiện theo các bước tuần tự. Quy trình gắn được mơ tả ở Hình 2.14: Trước khi được sử dụng, chip được rửa bằng cách bơm muối PBS 1mM vào trong kênh. Sau đó (1) Bơm dung dịch chứa 4 µM thiol PEG carboxylic acid (HS-PEG-COOH) vào trong kênh chính và ủ 12 tiếng trong nhiệt độ 4oC. Nhóm chức Thio (S-H) tạo liên kết với bề mặt điện cực vàng. (2) Sau khi ủ xong thì tiến hành rửa kênh bằng dung dịch muối PBS 1 mM ba lần. Tiếp đó bơm dung dịch hỗn hợp của 10 mg/ml 1-ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) và 5 mg/ml N- hydroxysuccinimide (NHS) vào kênh rồi tiến hành ủ một tiếng ở nhiệt độ 4 oC. Hỗn hợp này như một chất gắn kết giúp hoạt hóa nhóm COOH của PEG tạo ra liên kết nhóm amin với nhóm amin của antibody. (3) Sau khi ủ xong thì tiến hành rửa kênh bằng dung dịch muối PBS 1 mM ba lần. Sau đó bơm 0.2 mg/ml kháng thể huyết thanh bị (BSA) vào trong kênh và ủ 30 phút ở nhiệt độ 4oC. (4) Sau khi ủ 30 phút, kênh lại được rửa bằng dung dịch muối PBS 1mM. Sau đó 1% biotin (1 mg/mL) được bơm vào và ủ trong 30 phút ở nhiệt độ 4oC. Biotin giúp khóa các liên kết không đặc hiệu
65
giữa antibody và các đối tượng sinh học không phải là protein BSA. Sau khi ủ xong, vi kênh được tiến hành rửa bằng cách bơm dung dịch muối PBS 1 mM vào rửa. Sau khi kênh đã được rửa, điện cực vàng gắn kháng thể đã sẵn sàng được đưa vào sử dụng.
Hình 2.14. Quy trình gắn kháng thể bắt giữ protein lên điện cực vàng
Quy trình chế tạo một chip với các chức năng tập trung, chọn lọc và phát hiện protein đòi hỏi phải tiến hành nhiều bước. Việc tiến hành gắn kênh lên phiến kính phải đảm bảo mặt kính kết dính tốt với PDMS để có thể tạo ra được kênh nano trong q trình phóng điện. Việc kết dính giữa hai lớp là lớp kính và PDMS khơng tốt sẽ dẫn tới việc rò giữa hai kênh micro và không tạo được hiệu ứng làm giàu và làm nghèo ion. Việc chế tạo kênh chỉ 2 µm làm cho dịng chảy EOF hoạt động tốt hơn và hơn thế là việc tăng khả năng tập trung lại khi thể tích của vùng tập trung nhỏ đi do chiều cao của kênh nhỏ. Tuy nhiên việc chế tạo kênh 2 µm cũng làm cho việc gắn kháng thể lên điện cực vàng gặp khó khăn trong q trình rửa kênh. Do vậy quá trình
66
theo dõi gắn kháng thể trong kênh cũng đã được thực hiện bằng cách đo phổ trở kháng thay đổi khi các lớp sinh hóa ủ lên điện cực trong q trình gắn kháng thể.
Kết quả chế tạo chip